第六章 动物体外受精技术精要.ppt

三、体外受精效果的判断方法 1. 固定染色法：将体外受精的卵母细胞，用0.1%的透明质酸酶去掉周围的卵丘细胞，然后在醋酸酒精中固定24~28h，用含0.1%间苯酚兰溶液染色观察，有原核形成或发生卵裂者可初步判断为培养成功； 2. 体外培养：受精正常与否，主要体现在其随后的胚胎发育能力，因此可通过胚胎发育潜力进行评定。牛卵母细胞：受精后48h可检查分裂到2~8细胞的比例；体外培养7d后检查囊胚发育率；9d后检查囊胚孵化率。 四、我国体外受精的成功举例 1. 内蒙古大学旭日干院士在留学期间，于1984年3月9日培育出世界上第一例“试管山羊”。 2.内蒙古大学实验动物研究中心于1989年3月10日生产出国内首例“试管绵羊”。 五、体外受精技术存在的问题 1. 体外受精技术的效率有待提高。 （1）体外受精卵培养至桑椹胚及囊胚的发育率 较低 （2）胚胎移植后产仔率很低 2. 体外培养系统有待进一步完善。 3. 基础理论研究有待加强。 采集良种母牛的卵母细胞 卵母细胞的体外培养 采集良种公牛精子 精子体外获能 体外受精 良种牛体外受精胚胎 胚胎移植 受体牛 良种犊牛 成熟期牛 屠宰加工厂 市场 采集卵巢中的卵母细胞 “试管牛”工厂化生产的技术流程图 谢谢！ The end * 镜检卵母细胞－卵丘复合物： 用吸管吸取经静置后试管底部的混合物于平皿中，用吸管铺平，在实体显微镜下用吸管检出卵母细胞－卵丘复合物，置于另一平皿中，用洗涤液在实体显微镜下洗涤2次，在洗涤过程中要剔除不合格的卵母细胞－卵丘复合物。选择合格的卵母细胞－卵丘复合物非常重要，否则将降低卵母细胞的成熟比例。 卵母细胞－卵丘复合物分类标准 a、分类依据：卵母细胞的直径、形状、质地的均匀度、色泽；透明带的完整性；卵丘细胞围绕卵母细胞的完整性、数量、扩散程度、色泽。 一般分为4级，1、2级为合格；3、4级为不合格。 一级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密、完整， 质地均匀。 二级：卵母细胞：直径120μm，圆形，质地均匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞数层、紧密，但不完 整，质地均匀。 三级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地均匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、 不完整，质地均匀。 四级：卵母细胞：直径太大或太小，椭圆形，质地不均匀。 卵丘细胞：包围卵母细胞单层或无、不紧密、 不完整，质地不均匀。 退化的卵母细胞 可用卵母细胞 三、卵母细胞的体外成熟 未成熟的卵母细胞的核在细胞中央，成熟过程中迁移到动物极质膜下，核变得膨大，改称发生泡，接着进行第一次成熟分裂，减数分裂的完成标志着卵母细胞核的成熟 （1） 细胞核成熟 （2） 细胞质的成熟 显著的蛋白质合成发生在生发泡破裂前后，这些新合成的蛋白质不仅与卵细胞自身成熟有关（激活成熟促进因子），而且与卵母细胞输精后的发育能力直接有关，所以细胞质成熟的质量如何直接影响到早期胚胎的发育能力 胞质成熟主要表现为细胞器变化和纺锤体的形成 卵母细胞成熟后期细胞器完成重新组装，如高尔基体消失，线粒体分布核的周围，胞质内有PAS阳性的囊膜和脂滴 （3）细胞膜和透明带的成熟 细胞膜稳定性发生改变，膜微绒毛发生重排，表现密集而有弯曲，并从透明带内退出或断裂 透明带外层呈网状，变软 三、卵母细胞的体外成熟方法 1. 成熟培养液的选择 用于卵母细胞体外成熟的基础培养液有TCM199、Ham’s F-10等，添加胎犊血清（FCS）和犊牛血清（NCS）比添加牛血清蛋白（BSA）效果较高。可添加hCG和PMSG，促进卵母细胞的体外成熟。 2. 成熟培养的时间 对于大多数家畜来说，卵母细胞的成熟培养时间一般采用22～24h，但猪的卵母细胞多采用40～44h， 马的卵母细胞多采用30～36h。兔仅需12～15h。 3. 成熟培养的温度和气相环境 （1）温度 牛、猪、羊、马的卵母细胞成熟培养温度均采用38～39℃ 。 （2）气相环境 一般都采用5％CO2，来维持培养液的酸碱度； 4. 成熟培养系统 （1）开放培养系统 体积：将1～2ml成熟培养液置于平皿或五孔培养板中，然后放入50～200枚卵母细胞。 优点：简单；同时培养大量的卵母细胞；培