蛋白质相互作用的主要研究方法.doc

蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far estern blotting、生物信息学酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。（3）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的。这需要进行蛋白质的定位来确定。 免疫共沉淀试验也同样不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接相互作用的两种蛋白。例如E1A与p60的共沉淀就是间接的相互作用。其实际上是E1A与p107直接相互作用，而p107与p60直接相互作用的结果。与蛋白亲和色谱相比，免疫共沉淀试验的灵敏度不够高。这与抗原浓度较低有关，但如果使抗原过量表达，又会破坏相互作用的天然状态。 免疫共沉淀是检测蛋白质间相互作用的经典方法，也是较常用的方法。它的优点是：与蛋白亲和色谱一样，检测的产物是粗提物；抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应；蛋白以翻译后被修饰的天然状态存在；复合物以天然状态存在。Schaerer与他的同事们利用免疫共沉淀技术研究了GABAA受体蛋白与多功能蛋白gC1q-R之间的相互作用，与酵母双杂交试验得到的结果完全相同。 其缺点是免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通过第三者间接相互作用的蛋白，另外，其灵敏度不及蛋白亲和色谱高，因为感兴趣的蛋白浓度不如后者高，这样驱动复合物形成的能力小免疫共沉淀的结果初步提示PKCα和IGF1R可能发生相互作用。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。Far-Western印迹最初发明用于32P标记的谷胱甘肽S-转移酶(GST)-融合蛋白表达文库的筛选，现在则用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。最近几年，Far-Western还用于检测受体-配体相互作用以及相互作用蛋白文库的筛选。借助这种分析方法，使许多研究变成可能，如翻译后修饰对蛋白质-蛋白质相互作用的影响，用合成的多肽作探针检测蛋白相互作用的序列、以及在无抗原特异性抗体的情况下识别蛋白质-蛋白质相互作用。 Far-Western印迹技术与Western印迹十分相似。在Western印迹中，运用抗体检测转移膜上的相应抗原。在经典Far-Western印迹中，运用经标记的或可被抗体检测的“诱饵”蛋白检测转移膜上的“猎物”靶蛋白。用SDS（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）或非变性PAGE分离含有未知靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转膜。靶蛋白附于转移膜表面时可以被检测到。转膜后，封闭膜，用一已知诱饵蛋白（通常用纯品）进行探测。诱饵蛋白与靶蛋白反应