0植物DNA的提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳–1225050026高丽.doc

植物总DNA的提取、电泳检测及PCR扩增 95 一、实验目的 1. 理解用CTAB法提取植物组织 DNA的原理，掌握CTAB法提取植物组织DNA 的方法。 2. 学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法，理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。 3．了解引物设计的一般要求。 二、实验原理 copy后要修改 由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质，因此一般的提取真核细胞基因组DNA的方法用在植物细胞上并不十分有效。十六烷基三甲基溴化铵（cetyltriethy lammonium bromide, CTAB）法是常用的提取植物细胞基因组DNA的方 法。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸复合物是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70 －75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 植物DNA的提取程序应包括以下几项：①必须破碎或消化细胞壁释放出细胞内容物；②必须破坏细胞膜及核膜，使DNA释放到提取缓冲液中，常用CTAB一类的去污剂使细胞膜崩解；③DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，可利用氯仿、RNase等除去。一旦DNA释放 出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。CTAB法提取植物DNA，方法比较简单，适用于大多数植物。虽然得到的DNA纯度不是很高，但仍能满足限制性内切核酸以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。 三、实验材料、试剂和仪器 1. 材料 新鲜的植物组织（如幼叶、花 器、幼根）或-80℃冻存的材料。 仪器、用具:离心机、紫外分光光 度计、微量移液器、吸头、吸水纸、 水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、pH 计、高压灭菌锅、一次性手套、电泳 仪、电泳槽、微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪(PTC－100)，台式高速冷冻离心机等。 2. 试剂 （1）2×CTAB缓冲液100ml（见 改进的CTAB提取植物DNA方法）： 各试剂用量重新计算 （2）β-巯基乙醇；70%乙醇；异丙醇 （3）氯仿/异戊醇（24:1,v/v）：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混 匀， 置棕色瓶中，4℃保存。 （4）5×TBE 电泳缓冲液（pH8.0）（1L）： Tris 54g；硼酸27.5g； Na2EDTA·2H2O 3.72g。用pH计测定。临用前稀释至0.5×TBE 电泳缓冲液 （5）6×上样缓冲液：0.25%溴酚兰、40%蔗糖 （6）10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus) ；dNTP Mixture (各2.5 mM) TaKaRa EX Taq 聚合酶5U/μl （7）模板DNA (已预先稀释)；上、下游引物混合物（已预先稀释） 四、实验步骤 （一）植物DNA提取 1．在5 mL离心管中，加入800 μl的2×CTAB, 65℃预热。用前加入20 μl β-巯基乙醇。 2．取嫩的组织材料1.0 g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，充分混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。 3．加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一5 ml新管中。 4．吸上清到新管中（5mL离心管），用氯仿/异戊醇重复抽提一次。 5．加入2倍体积的100%乙醇或 0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min或-80℃放置 1