第4章动物细胞与组织培养—2012.pptVIP

4.3 发展简史 第1次成功地培养脊椎动物细胞是在1907年,美国科学家Harrison首先利用蛙淋巴液来培养蛙胚神经管,并观察到神经纤维是由细胞质进行阿米巴运动所形成,解决了当时争论不休的神经纤维起源问题。是动物细胞组织培养的奠基人。 1912年德国科学家Carrel采用更换培养基和传代的方法解决了组织块长期存活的问题；设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1943年,Earle首先培养C3H小鼠的结缔组织并用致癌物20-甲基胆蒽处理,获得了能回种于小鼠体内并生长肉瘤的长期培养的细胞系,定名为L细胞系。 5年之后,Sanfold使用预先处理的条件培养基(condition medium)成功地使L细胞系的一个单细胞在体外发展成“克隆”(clone)并繁殖成克隆株。 1951年Gey成功地用人的宫颈癌组织建立起能在体外连续培养的人的肿瘤细胞并定名为HeLa细胞系。这些细胞至今仍在世界各国广为应用。L与HeLa细胞系就成为最早建成的动物与人的细胞系。 1955年Eagle研制成人工合成的培养基,使组织培养工作的劳动量大大减轻。 20世纪70年代Sato等人发展了无血清培养,解决了血清中存在的一系列问题,使细胞培养技术得到长足的发展,并推动了基因工程产品及其产业的发展。 20世纪70年代以来,我国组织培养技术发展更快,它已不再是个别研究室所拥有的技术,而是已成为生物学和医学研究中普遍应用的手段。近20年建立的各种细胞系已不可胜数。最近我国科学家对干细胞的研究已走在世界前列,特别是治疗性克隆研究已达到世界先进水平。 4.5 动物细胞、组织培养的基本技术 1、培养细胞的生长特点 2、培养细胞的生长过程 3、动物细胞培养的基本条件 4、动物细胞培养的传统方法 5、原代培养技术 6、传代培养技术 7、贴壁技术 8、细胞系与克隆株 9、细胞的常规检查 10、细胞保存技术 干细胞发展史 1878：出现第一篇哺乳类的体外受精卵报导。 1959：完成第一例兔子的体外受精卵。 1960：展开畸胚瘤的研究。 1968：爱得华（R.G. Edwards）和贝敏思特（B.D. Bavister）进行人类的体外受精研究。 从1970年Martin Evans首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞，到原被误认为功能单一的干细胞后被证实具有自我复制能力，且可分化为人体206种组织器官的原始细胞。 1978：世界第一个试管宝宝路易丝．布朗（Louise Brown）在英国诞生。 1980：肯蒂丝．瑞得（Candace Reed）成为澳洲的第一个试管宝宝。 1981：艾凡斯等（M.J. Evans, et al.）体外培养老鼠的胚胎干细胞；伊莉莎白．卡尔（Elizabeth Carr）成为美国的第一个试管宝宝。 1984～1988：安德鲁等（P.W. Andrews, et al.）在体外培养人类畸胚瘤细胞。 1989：佩拉等（M.F. Pera, et al.）制造人类畸胚瘤细胞株。 1994：首次使用人类人工受精的囊胚进行干细胞的研究。 1995～1996：从恒河猴取得胚胎干细胞，并在体外培养分化成三种胚层。 1998：詹姆士．汤姆生（James Thomson）从人类体外受精卵取得胚胎干细胞，并能稳定地在体外培养；吉尔哈特（J. Gearhart） 从妊娠中止的胎儿内取出其卵巢或睪丸组织，得到一种具有干细胞特性的原始生殖细胞，称为人类生殖干细胞。 1999：《科学》（Science）杂志公布干细胞为世界十大科技进展榜首。从小鼠肌肉组织取得的成体干细胞可以「横向分化为血液细胞」。此后，科学家相继证实成体干细胞具有可塑性。 2000：美国61名诺贝尔奖得主及其它科学家联名要求美国政府对干细胞研究给予全面支持，同年美国总统柯林顿宣布美国政府准许用政府经费进行人体胚胎干细胞研究。 2001：胚胎干细胞株可以培养出神经、胰岛等更多种类的细胞。美国总统布什宣布联邦政府将有限资助胚胎干细胞研究。 2002：《自然》（Nature）杂志评选「干细胞的争议」为2002年科学界年度重大新闻。 根据细胞特点，掌握细胞消化时间和选择消化方法。 7、贴壁技术 贴壁培养的材料与系统 （1）主要材料： 玻璃 塑料 金属 微载体 （2）系统： 微载体培养系统 多孔载体培养系统 中空纤维培养系统 微载体培养法(microcarrier culture) 载体：DEAE-交联葡聚糖微粒、DEAE-纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、无机玻璃基质微载体等。 微载体培养系统培养细胞步骤： 1、选择合适的微载体类型——获得最大量的细胞，以微载体能全部悬浮在培养液内为最好。 2、浸泡水化及消毒 用无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲液浸泡3h以上