2016-5基因工程及其应用选编.ppt

如何获得目的基因？ cDNA基因克隆 基因组 DNA 文库 限制性内切酶消化 机械随机切割 PCR方法获得目的基因 五 基因工程的常用技术和方法 （一）cDNA基因克隆 cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。 1、没有原核生物的cDNA 文库 原核生物的 mRNA 非常不稳定； 原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。 ２、cDNA 文库对于真核生物的基因分析 cDNA文库是只含有编码蛋白的基因文库 cDNAs 没有内含子 ? 基因可以在E. coli 中直接表达 得到mRNA 反转录获得cDNA ３、mRNA 分离原理 １） 传统的分离方法是用oligo (dT)-纤维素柱分离总RNA ２） 把oligo(dT) -磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA ３）用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA ４、三种分离mRNA的方法 （二）基因组 DNA 文库 纯化基因组DNA 基因组DNA的片断化:物理切割和限制性内切酶 eukaryotes:从细胞核中去除蛋白,脂类和其他杂质. prokaryotes:直接提取 Hae III：5’- …GG /CC… 3’, Sau 3A: 5’-/GATC-3’, Alu I: 5’- …AG/CT… 3’, BamH 1: 5’-G/GATCC-3’ （三）限制性内切酶消化 1、将片断的末端 (粘性或平头) 和酶消化的载体连接 2、酶切位点是否被修饰 3、内切酶消化的时间和用量取决于要插入片断的大小范围 两个特点: 第一 是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。 第二 一般常用的限制酶大多识别6个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小，因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。 （四）机械随机切割 可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb ），从而克服上述的两处缺点。 　不足之处： 所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体DNA进行连接。 有一些序列不能被克隆 Example: 1)序列缺乏酶切位点; 2)目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片断上 Too long for the vector used （五）PCR方法获得目的基因 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 特点：在体外模拟细胞内进行的DNA复制过程 根据需扩增片段的两端设计引物。 使DNA解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应。 特点：需要很少的DNA模板，且能直接从基因组中得到目的基因。 (1)大肠杆菌DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ） DNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ） DNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ） PolⅠ和Pol Ⅱ的主要功能参与DNA的合成； Pol Ⅲ的功能同DNA的复制有关； PolⅠ同DNA分子克隆的关系最为密切。 大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ： 1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为109?1000dal。 DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3’ 5’的外切酶活性和5’ 3’ 的聚合酶活性，另一个具有全部 5’ 3’的外切酶活性。 DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件： a底物： 四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）； bMg＋＋离子； c带有3’-OH游离基团的引物链； dDNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。 DNA聚合酶Ｉ5’ 3’的核酸外切酶活性 （a） 5’ 3’的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；