分子生物学实验技术_DNA转化.ppt

分子生物学实验技术---DNA转化 转化：将质粒导入大肠杆菌或其他细胞内 的过程叫转化。 与噬菌体不同，质粒本身不具备感染细胞的能力，这种具有接受外源DNA能力的细胞叫感受态细胞 制备感受态细胞 CaCl2 法 原理：细菌处于0oC,CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNAase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42oC短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 技术要点：使菌体始终保持低温状态，（从低温突然提高到42℃短时间热刺激，应激反应下可产生大量cAMP，而cAMP可改变细胞膜通透性，促使细胞吸收 DNA复合物，从而大大提高转化率）。因此操作上既要谨慎，又要迅速。 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的） 实验步骤 1.从铺有大肠杆菌平板中挑选一个单菌落，接种到 2~3 ml LB培养基中，37oC振荡过夜培养 2.转接到100ml LB培养液里，加1ml（1：100）预培液， 37oC振荡至细菌对数生长期A600=0.4~0.7（2~4h） （用对数期细菌因为对数期细胞生长旺盛，新生细胞壁薄，细胞膜通透性好，外源DNA容易进入 ） 3.取1ml培养液加入到1.5ml离心管,根据实验具体要求确定管数 4.4oC,1300g(4200rpm)离心,10min 5.弃上清,向各1.5ml离心管加入冰预冷的0.1MCaCl2溶液500ul,混匀后置于冰上10min 6.4oC,1300g(4200rpm),离心10min 7.弃上清，向各1.5ml离心管中加入冰预冷的0.1MCaCl2溶液100ul，混匀后置于 4oC冰箱备用。 如暂时不用可加入体积15%甘油，-70oC保存 电转化法 1.取1ml 37oC 150rpm过夜培养的菌液加入含有100ml LB液体培养基的三角烧瓶中37oC，培养2~3h（OD=0.5~0.8） 2.将菌液分装至2个50ml离心管中，冰浴30min 3.4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加入50ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀（清洗的目的是去掉细胞溶液里的各种杂质。在高压电的情况下， 多余的离子将破坏细胞结构 ） 4. 4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加入25ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 5. 4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加入10ml预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 6.4oC,4000g.离心10min，弃去上清，分别加入400ul预冷的10%甘油，轻轻吹打混匀 7.40ul每管分装，4oC保存 化学转化 1.在冰上将感受态细胞化冻。 （不可手温化冻） 2.加入质粒2~5ul 。 3.冰上静置30~60min。（质粒与大肠杆菌接触时间越长越好） 4.42oC水浴锅热激30~90s（CaCl2作用于细胞膜，使通透性增大，在热击作用下，附着于大肠杆菌表面的质粒DNA进入细胞内。热击时间决定于管壁厚度与菌株种类） 5.迅速转移至冰上，静置2~3min。 6.加 900ul 42oC的LB肉汤，37oC保温30~60min。 7.涂于平板上。 电转化 原理：利用瞬间高压使细胞壁产生小孔而接受外源DNA。操作中需要将DNA溶液中的盐分全部去掉，否则因盐分而产生高电流，高电流产生火花而杀死大肠杆菌 实验步骤 1.感受态细胞（40ul）于冰上化冻。 2.取1~2ul质粒DNA加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置5min。 3.DNA溶液转移至转化杯中，轻轻晃动使之落入转化杯底部 4.按电击开关按钮。 5.迅速加1ml预热至37oCLB肉汤，并移至ep管中，37度震荡30~60min 6.涂于平板上 注意事项 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 2. 质粒的质量和浓度: 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 * * *