真核基因在大肠杆菌中的表达3.ppt

大肠杆菌表达真核基因的劣势 转录信号的不同：真核基因转录的mRNA不具备结合细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的RNA聚合酶不能识别真核启动子。 Lac启动子的表达载体 如何提高目的蛋白的可溶性表达 3.与分子伴侣或折叠酶共表达。 常用的分子伴侣有： GroES-GroEL DnaK-DnaJ-GrpE ClpB 常用的折叠酶有： peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIs) disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC) protein disulfide isomerase (PDI) 4.分泌表达：使目的蛋白分泌到周质空间。 周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。 周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。 周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。 可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。 5.使用特定的菌株。 AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB). Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor). 6.与可溶性多肽融合表达。 7.表达目的蛋白的一个片段。大于 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。 8.体外去折叠，重新折叠。 表达部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位表达的蛋白不易被降解。 分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的正确折叠。 一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，不同类型分子伴侣彼此协调参与蛋白质的折叠。 1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现： a.降低培养温度 b.使用弱启动子 c.使用低拷贝数的质粒表达载体 d.降低诱导物的浓度 2. 改变培养基。 a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子 b.加入缓冲液保持pH稳定 c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子 d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子 e.加入乙醇、硫醇等 第四节 影响真核基因表达效率的因素 影响因素： 启动子的强度、DNA转录起始序列 密码子的选择、 mRNA的二级结构 转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性 寄主细胞的生理特征等 1. 5’-UTR对克隆基因表达效率的影响 启动子结构的影响： 启动子序列具有2种保守序列，即-35区(5’-TTGACA)和-10区(5’-TATAAT)。启动子序列与此越相似，其表达能力越强。 -35区和-10区之间的距离：也是影响克隆基因表达效率的重要因素。距离越接近17bp，启动子的活性越强。 对于某些启动子，-35区上游的10-100bp序列：起上游激活物的作用。 启动子与克隆基因之间距离的影响： 发生2-3nt长度的变化，就能显著影响翻译的效率。 与质粒mRNA 5’-端的二级结构有关：SD序列或AUG密码子参与mRNA分子的碱基配对会明显降低mRNA的翻译效率。 要获得良好表达， AUG密码子或SD序列必须处于易接触的部位，以利于与核糖体结合起始翻译过程。 mRNA 5’-末端与SD序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离小于15nt时，翻译效率会显著下降。 提高克隆基因表达效率的方案： 建立克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位置上，从重组体中筛选产量最高的克隆。 对于表达产物难以测定的基因，可先将其N-端片断与报告基因融合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性来筛选克隆基因有效表达的重组菌落。最后将该质粒中的报告基因用克隆基因的C-端片断替换，即得到高效表达克隆基因的重组质粒。 质粒的拷贝数的影响： 提高表达效率的途径：增加mRNA的数量。影响mRNA合成速率的因素有两种，即启动子的强度和基因的拷贝数。 提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。 质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失 保持抗生素的选择压力 将质粒分配功能区par克隆到质粒载体上 2. 质粒的生物学特性对表达效率的影响 3. mRNA转录物的分子特性对表达效率的影响 转录起始序列的影响： SD序列的影响：起始密码子上游的5-10nt，核糖体的结合位点。与16S rRNA互补程度越高，转译的效率越高。 SD序列后的4个碱基的影响：为4A或4T时转译效率最高，为4C或4G时效率只有最