第16章第17章基因诊断、基因治疗.ppt

第一节 基因诊断的技术方法 一、基因诊断中常用的分子生物学技术 （一）核酸分子杂交技术——Probe技术 1．Southern印迹法：能检出特异的DNA片段，且 能进行定位和测定分子量。可用于基因突变分 析、酶切图谱分析。 2 ．Northern印迹法：可用于细胞中RNA的定性、 定量分析。 3 ．斑点杂交：可用于基因组中特定基因及其表 达的定量定性分析，但不能测基因的分子量。 4 ．原位杂交：可查明染色体中特定基因的位置， 用于染色体病的基因诊断。原位杂交可检出 含核酸序列的具体细胞，细胞具体定位、数 目及类型，可检出基因和基因产物的亚细胞 定位。 （二）聚合酶链反应（PCR） 在基因诊断中应用广泛，在应用中常与其他技术联合应用；也可单独应用于基因诊断。 （三）单链构象多态性分析 Single strand conformation polymorphism（SSCP）分析是基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。DNA 变性 单链DNA 中性 形成特 定的构象 PAGE 迁移率分析。常与PCR联 合，称为PCR/SSCP技术。 （四）限制性内切酶谱分析 基因突变可导致某一限制性酶切位点的丢失或增加，经同一限制酶消化待测DNA和野生对照DNA，比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异，可以判断待测DNA的突变情况。常与PCR联合应用。 （五）DNA序列测定 是检测基因突变的最直接、最准确的方法；不仅可以确定突变的部位，还可确定突变的性 质。与PCR联合应用。 （六）DNA芯片技术 是一种基因分析和检测的新技术，以其快速、敏感、高效、平行化、自动化等特点，已成为新一代的诊断技术。应用DNA芯片，不仅可以检测基因结构及其突变、多态性，而且对基因的表达情况也可进行分析，故在基因诊断中其应用前景是非常广泛的。 二、基因诊断的基本方法 内源性基因的变异和外源性基因的入侵均可 致病，根据其病因，可采用相应的基因诊断的方 法。 （一）基因突变的诊断 1. 诊断已知的点突变:突变位点已阐明的遗传病,可采用: 1）PCR/ASO（allele specific oligonucleotide）法进行检测。例如C→T，根据该位点两侧的碱基 序列，设计一对引物1．2，进行PCR扩增，扩增 产物与ASO探针（M ． N），进行斑点杂交，然后 对其杂交结果进行分析。M的中央碱基为A，N的 中央碱基为G。 M：● ● ○ N： ● ● ○ 杂合子 纯合子 正常 患者可能是一种新的突变类型 2）DNA芯片技术，不仅可以诊断已确定的突变类 DNA芯片技术可用于大规模未知突变的筛查，更 显示其优越性。筛查n个碱基序列中每个碱基的 突变，则需要4×n个探针。例如在1.28cm2的支持 物上原位合成16000个寡聚核苷酸探针（7核苷酸， 47=16384Probes），通过一次杂交即可快速确定 4K b序列内所有的点突变及其部位。 2．少数核苷酸缺失或插入的诊断：可采用检测 点突变的技术方法。 型，还可确定新的突变类型。 设计四个探针，其中央碱基分别为A、G、C、T， 预合成后显微打印在支持物上，制成DNA芯片， 然后与扩增产物进行杂交，对杂交产物进行分析。 图： A T ○○ ●○ ● ○ ○○ ○● C G　 ○● ○○ ○ ● ●○ ○○ 正常 C→T C→T C→G C→A