流式细胞术的质量操纵.ppt

流式细胞术的质量控制和影响因素 河北省肿瘤研究所左连富 * * 一、标本的采集和固定方法的质量控制 标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，需注意： ①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。 ②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。 ③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。 例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度固定效果好，高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良，有作者分析研究了自溶对DNA测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随时间的延长，DNA含量呈梯度降低， 根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检测质量也有显著的影响，例如细胞DNA的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度，实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。 如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择，在不能及时检测又没有低温保存条件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点。 如所测抗原物质在细胞内，可以使用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱(0-4℃)放置即可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。 二、单细胞悬液制备的质量控制 人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态，它是流式分析最合适的样品来源，全血中含有多种有形成分，流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象，因此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来，例如，以淋巴细胞DNA定量分析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而将其他有核细胞或红细胞去除，对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤，出现血小板凝集。 新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料来源，但对其分散单细胞样品的技术和方法，仍存在着很多问题，仍需大量的探索工作，就目前，国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法，甚至同样组织，用于不同的实验目的，就需要不同的方法处理，或者每一种组织就是一个单独的问题，因此必须根据实际情况，去选择合适有效的单分散方法，选用的方法必须达到细胞产量高，细胞损伤小的目标，但实际工作中达到这个目标是困难的，多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法，化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等，根据各种组织的特点，以及实验目的的不同，可选择不同的方法。 ①选则酶学方法时，应注选择使用酶类型的问题，含有大量结缔组织的组织器官，选择胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或膜酶，并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间，pH值，浓度等方面对酶活性的影响，酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结果，由于酶学方法分散下来的细胞产量低，用组织较多，还要注意酶的纯度，活性单位，以及生产厂家对酶的污染。 ②化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合使用，分散效果更佳。 ③机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细胞碎片多，细胞团块多，在使用机械法时，要给于组织适当的压力，这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。 ④低渗方法，其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放出来，是一个裸核悬液样品，本方法简便，可以改变样品的变异系数，但要避免脱核时间过长，造成核膨胀碎裂。 以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法，往往不是单用，常常是一种或二种方法的结合使用，总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困难，因此还需要深入探讨流式样品的制备技术，制备出完整细胞产量高，细胞损伤小的合格悬液 , 获得更好的流式检测结果。 三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制 石蜡包埋组织标本的材料选择，应经病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核实病理诊断。 切取适当厚度的石蜡组织片，大量研究证明，切取40-50μm厚度的切片是适宜的，过厚的组织片消化费时，消化下来的细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞碎片，影响检测结果，使肿瘤异倍体的检出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度(5,1