基因操作的工具酶.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 3.T4 DNA聚合酶 来源：从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到 具5’ 3’聚合酶活性和3’ 5’外切酶活性 * Taq DNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol／L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性 自1976年从Thermus aquaticus菌中分离纯化后，直至1985年PCR概念形成，才将此酶应用于PCR技术的建立和完善。对基因克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大作用 4.Taq DNA聚合酶 * 5.逆转录酶 一种有效的转录RNA成为DNA的酶，即以RNA链为模板，以带3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’ 3’方向合成DNA链 产物DNA又称cDNA，即互补DNA 逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase），存在于肿瘤病毒中 主要用途：转录mRNA成为cDNA制备基因片段 * * 催化RNA体外合成反应 依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶 6.RNA聚合酶 * 五.DNA和RNA的修饰酶 核酸酶 碱性磷酸酶 磷酸激酶 末端脱氧核苷酸转移酶 甲基化酶 * 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切或外切酶（许多兼有内外切活性） 5’-核酸酶或3’-核酸酶 常用：BAL31核酸酶、核酸酶S1 、绿豆核酸酶、RNaseA 、 RNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体外切核酸酶等 1.核酸酶 * 核酸酶 非专一 专一性 内切酶 外切酶 RNA DNA 内切酶 外切酶 外切酶 内切酶 3＇-核酸酶 5＇-核酸酶 非限制性 限制性 3＇-核酸酶 5＇-核酸酶 * 1）核酸酶SI 功能： 降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的单或寡核苷酸片段 应用： 分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位 切除DNA片段上的单链末端，形成平末端 切开cDNA合成过程中形成的发夹环 在限制酶位点上产生小缺失 * 核酸外切酶III 核酸外切酶VII DNA酶I RNA酶A (牛胰) RNA酶TI RNA酶H 其他常见核酸酶 * 2.碱性磷酸酶 功能：催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’ 端磷酸基团, 从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接 用途： 在用γ-P32磷酸和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸酶处理 在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接 * 细菌碱性磷酸酶（BAP）：E.coli中分离 牛肠道碱性磷酸酶（CIP）：牛肠道分离 BAP活性更高, 对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性 除去CIP可用蛋白酶K降解 分类 * 对核酸末端羟基进行磷酸化的酶，用途： 放射性标记DNA链的5‘末端，探针标记 Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5＇磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化 特性： 该酶很难纯化,酶制品经常不纯 铵离子是该酶的强烈抑制剂 低浓度的磷酸也可抑制该酶活性 3.磷酸激酶 * 4.末端脱氧核苷酸转移酶 来源：小牛胸腺 功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着5’　　　3’加到DNA链的3’-OH末端。该过程不需要DNA模板，对双链、单链DNA都适用。经常用于人工粘性末端的构建 * * 5.甲基化酶 甲基化：能识别限制酶识别的序列，识别顺序中的某个碱基发生甲基化（常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰），属修饰酶类。经修饰的DNA不再被限制酶降解 细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase）来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序 真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(M5C) * 已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在对应II类限制酶名称前加一个M表示 如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC) 3’-端的A甲基化(GAm6ATT