分子生物学（张海红）第二代测序技术.pptVIP

第二代高通量测序技术简介 四大高通量测序平台 Solexa，454 (GS-FLX)， SOLiD和Polonator 测序原理 合成法测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(Sequencing by Ligation) 454 (GS-FLX) Roche：（2005，2007，2008） 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。 454 (GS-FLX)流程 1、文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。 454 (GS-FLX)流程 2、Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，回收纯化； 454 (GS-FLX)流程 3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。 454 (GS-FLX)流程 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息 Solexa-Illumina Genome Analyzer 核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。 原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。 SOLiD ABI(Applied Biosystems)：SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 原理 ：用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。 SOLiD流程 1、SOLiD基因组文库的构建 SOLiD流程 2、油包水PCR SOLiD流程 3、含DNA模板P1磁珠的固定 SOLiD流程 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程 Polonator 测序原理：  Polonator系统高质量测序是一种以连接反应进行DNA序列分析的技术，该系统采用结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板，以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行大规模高通量测序。 Polonator流程 * * 5. 数据分析原理 *