论文：纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用.doc

纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用 朱建发 肖 静 左 涛 易 威 （化学与分子科学学院 湖北 武汉430072） 摘 要 超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内一种重要的自由基清除剂猪血液里Cu?Zn-SOD与血红蛋白共存于红血球，用有机溶剂沉淀蛋白质，得到粗酶提取液，用纤维素铜氨溶液制备一种成本较低，具有高分辨性能和良好物理性能的新型尺寸排除色谱，用梯度淋洗的方法纯化Cu?Zn-SOD。 关键词 Cu?Zn-SOD 尺寸排除色谱 梯度淋洗 介绍 Cu?Zn-SOD及其分离纯化 Cu?Zn-SOD与血红蛋白共存予红血球中，它是一种重要的自由基清除剂，对生物有保护作用。这类酶的发现促进了自由基生物学的发展，并为人类治疗多种炎症，放射病，自身免疫疾病及抗衰老等提供了一个具有广泛应用前景的药物[1]。 用CHCl3-C2H5OH处理，使血红蛋白沉淀，Cu?Zn-SOD留在水-乙醇相中，加磷酸氢二钾可使SOD的含水乙醇相分出，钾丙酮使SOD沉淀，极性溶剂使蛋白质脱去水化层，降低介电常数，使蛋白质颗粒凝集沉淀。 纤维素柱填料及生物高分子的分级排除色谱 过去的三十年中，由于纤维素膜在膜相对较低的价格，与生物化合物较好的相容性和明显的亲水性，使得其在分离中已有了广泛的商业用途[2，3]。 尺寸排除色谱就是使高分子流过孔径具有一定尺寸分布的色谱柱填料， 分子量大的高分子尺寸较大，进入孔隙的可能性小，流经填料时间校短，反之，分子量小的，流经填料时间长。此法在生物大分子的实验室研究和工业生产中得到了越来越广泛的应用[4，5]。 采用PEG－2000和纤维素铜氨溶液共混，制得了强度很好的再生纤维素改性多孔膜，其孔径是未共混得纤维素膜的4倍。纤维素共混膜在不同凝固条件下可形成多孔膜，且孔径可通过加入的水溶性高分子的种类、分子量、含量控制，在此基础上制备了系列多孔色谱柱填料。 梯度洗脱法 梯度洗脱的能力是逐步增加的，克服了直线洗脱中的拖尾现象，混合物中的各个组分逐个进入解吸状态，因此分辨率大大提高，形成梯度应满足：（1）淋洗液总体积足够大，洗脱时间足够长，使各峰不致丢失；（2）梯度的斜度要足够平，使各峰分开，但又要足够陡峭，以免峰形过宽或拖尾；（3）梯度淋洗速度要适当，这样可利用全柱长进行无数次的解吸和再吸附，达到分离目的；（4）最大分辨率的梯度洗脱应在那些对吸附和洗脱有相近亲和力的大分子出现的区域比较平坦，而在毗邻大分子的亲和力差异较大的区域是陡峭的，通常要经过反复实验，摸索出一个合适的梯度淋洗配方来调节梯度，才能达到理想结果。 实验部分 实验试剂和仪器 试剂: CuSO4?5H2O,20%NaOH,PEG-2000,棉短绒，4％硫酸，异丙醇，浓氨水，95％乙醇，氯仿，K2HPO4?3H2O,K2HPO4,0.9%NaCl，丙酮，10mmol/LHCl，新鲜猪血500ml，甲醛溶液。 仪器： 抽滤装置，HL-2型恒流泵，BSZ-160A型部分自动收集器，紫外可见分光光度计，玻璃色谱柱，低温高速离心机等。 纤维素柱填料的制备 制备Cu（OH）2 取16.5g五水硫酸铜，加蒸馏水加热溶解至沸，停止加热，缓缓加入25％－28％的浓氨水溶液，并搅拌冷至室温后，用水将沉淀洗至中性，倒出清液，加水于沉淀中冰水浴条件下加l0％NaOH并搅拌，用水洗至中性，抽滤得天蓝色湿Cu(OH)2。 制备纤维素铜氨溶液 8g纤维素置于50g浓氨水中，加入13ml水后密封杯口，置于冰箱中冷至10oC以下，将10.4g新制的Cu(OH)2加入到6.4g10％的NaOH里，搅拌均匀后倒入冷却的纤维素铜氨溶液里，立即搅拌均匀，置于冰箱中冷却，冷却后加入少量水，继续搅拌，再冷却再搅拌，变为蓝色清亮粘稠液（Ⅰ），纤维素浓度约为8％。 柱填料的制备 将上步制得的纤维素铜氨溶液装入注射器中，均匀用力，推出丝状溶液，直接在10％NaOH溶液中凝固15min，将丝状物转移到4％的稀硫酸中，放置30min，得到透明均匀细丝，用水洗去酸，剪成1mm以下圆柱体，保存在20％异丙醇和2％甲醇水溶液中备用。 酶的制备 取新鲜猪血500ml，3000转/min离心20min，收集红细胞后，加入等体积0.9％NaCl溶液，充分搅拌后，再次离心，弃上层清液（反复3次），收集洗涤的红细胞，加蒸馏水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40min以上，得血溶液。 往血溶液中缓慢加入在4oC下预冷过的95％C2H5OH（0.25倍体积），然后缓缓加入在4oC下预冷过的CHCl3（0.15倍体积），搅拌，室温下3000转/min离心20min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上层清液约，即粗酶提取液。 往上述溶液中加K2HPO4?3H2O(按43