实验步骤1.doc

收集细菌和提取粗蛋白 收集细菌和提取粗蛋白 (1)过滤菌液。 即把菌液倒入含有滤纸的漏斗中过滤，将杂质除去。 (2)离心收集菌体。 把已过滤的菌液以10000 rpm 4℃离心20min，去掉上清，收集沉淀，再用PBS清洗沉淀以12000 rpm 4℃离心20min，收集沉淀，用PBS悬浮于EP管中。 (3)超声波破碎细胞。 即把收集沉淀的EP管放在超声波细胞破次破碎2s，冷却3s，每组20次，共30组；直到菌液变澄清 (4)收集粗蛋白。 把已破碎的粗蛋白放入4℃，10000 rpm 离心20min，分别收集上清和沉淀，并放入 - 20℃的冰箱中保存。 周质蛋白，膜蛋白，胞内蛋白分离 取一份湿重约为0.1g的菌体内加入高渗液10 mL，在室温环境缓慢摇动15min；低速离心 (6000 rpm)重新收集菌体后，快速加入低渗液10mL，混匀，冰浴15min，4℃下16000 rpm离心10min，收集上清，得到周质蛋白溶液。 将离心沉淀用PBS悬浮，放在超声波细胞破碎仪中，每次破碎2s，冷却3s，每组20次，共20组；4℃下14000 rpm离心10min，收集上清，此上清为膜蛋白和胞内蛋白的混合物。 将周质蛋白溶液调pH至2.5，膜蛋白和胞内蛋白的混合物分别调pH至2.5和7.4，准备好的蛋白用于酶活性测定和亚细胞定位。 丝氨酸乙酰转移酶酶活测定 反应体系为（500(L）：Tris–HCl缓冲液（pH 7.6），63 mM；Na2-EDTA1.25 mM；DTNB1.25 mM；acetyl-CoA0.1 mM；L-serine1 mM；25(L丝氨酸乙酰转移酶。混合后于412nm处测定吸光值变化，同时做不加L-serine的空白对照。Tris（pH 7.6）Na2-EDTA DTNB acetyl-CoA L-serine L-serine需要稀释，加入量是50ul 粗蛋白 配置量 50ml 50ml 1ml 1ml 25ul 浓度 0.1M 0.01M 0.005M 0.1M 水 加入量1 0.6602g 0.1861g 0.0041g 0.1051g 加入量2 315ul 62.5ul 10ul 0.5ul 腺苷酞硫酸还原酶(APS还原酶)活性的测定 Tris（PH 8.0）125 mM； K3Fe(CN)6 1.25 mM； EDTA 20 mM； AMP 1.0 mM ；Na2SO3 10 mM（亚硫酸盐必须是用Tris（PH 8.0）新配的，并且包含0.005M的EDTA）；反应体系为2650 ul，在420nm处测定吸光度，25℃ 下以反应体系中用等量的灭菌水代替酶液做空白对照。 名称 Tris （PH 8.0） K3Fe(CN)6 K3Fe(CN)6需要稀释，加入量是33.1ul EDTA AMP Na2SO3 粗蛋白 水 配置量 50ml*2 1ml 50ml 1ml 50ml 25ul 1455.4ul 浓度 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M 定容用Tris（PH 8.0）且加入0.07306g EDTA 加入量1 0.6602g 0.32925g 1.4612g 0.0499g 0.6302g 加入量2 315ul 3.3125ul 530ul 26.5ul 265ul 半胱氨酸合成酶： 200ul体系： OAS 1.5mM；硫化钠 3mM；二硫苏糖醇 10mM；磷酸钠 12.5mM； PH 8.0 反应开始于加入硫化钠，然后在26℃ 孵化10min。然后移除 150ul，然后加入350ul的酸性的茚三酮（茚三酮溶于混酸中，混酸按照盐酸 : 醋酸1：4配比，茚三酮的质量百分比为1.3%）来测定半胱氨酸的浓度。再将体系放到100℃水浴10min进行颜色的变化，迅速放到冰上，并且加入700ul的乙醇。然后在550nm处测定吸光度。一个酶活单位定义为：在1min内转化1nmolOAS为半胱氨酸的酶的量。 名称 OAS 硫化钠 二硫苏糖醇 磷酸钾 茚三酮（用混酸配） 混酸 Hcl：HAc 配置量 50ml 50ml 50ml 12.5ml：37.5ml 浓度 0.01M 0.1M 乙醇 加入量1 0.12g 1.3315g 0.65g 700ul 加入量2 60ul 25ul 350ul 亚硫酸盐还原酶： 于25 ℃条件下移取 1 mL 酶液于试管中, 分别加入 5 mL 0.05 mol/L, pH7.7 的K3PO4溶液、含0.1 mmol/L Na2EDTA 缓冲溶液、1 mL 0.02 mmol/L NADPH 和 5 mL 0.5 mmol/L Na2SO3 作为