酶活力测定方法.ppt

连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。 检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。 每30s A的改变：0.015～0.018，呈线性关系的时间不得少于3min。 相当于的单位数为 每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为 重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽图分析 肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。 1。酶切条件 取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%ＮＨ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。 2。ＨＰＬＣ系统测试 ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分析。 3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。 练习与思考 * 2．酶活力测定法 1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。  酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。 通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。 酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。   酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。 2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、 适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。 温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或 37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。 辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要 相应的辅酶。 空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。 对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。 3）测定方法： 取样测定法： 示例：胰蛋白酶效价测定胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键供试品溶液：50～60单位/ml底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 浓度：A：0.575～.0585N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸  253nm处的A随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。 酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。测定：空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白酶单位。 供试液的A每分钟改变 返 回 *