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植物病理学讲义 李永刚 2012年9月10日 实验一 真菌培养基的配制与灭菌 目的 了解培养基配制的材料要求及过程，并掌握灭菌需要条件及过程。 材料 马铃薯、琼脂、葡萄糖 步骤与方法 成分选择：马铃薯、琼脂、葡萄糖 称量：马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、水1000ml 调配：在铝锅内加入少于1000ml水加热，将马铃薯用切刀切成5mm3小块，放入铝锅中40分钟 过滤澄清：将马铃薯块过滤去，将滤液加入铝锅内，补充水1000ml加入琼脂、糖。 分装：用三角架、漏斗将溶化好的培养基置入三角瓶及试管内，塞好棉塞。 灭菌：放入湿热灭菌锅内，灭菌30分钟，之后试管要斜放。 实验报告 按小组进行真菌或细菌培养基的制备，灭菌。注意培养基制备的重要环节。 思想题 干热灭菌时为什么要将玻璃仪器冼净，晾干后才能装箱灭菌？ 湿热灭菌时需要按标定量加水，加水过多或过少会有什么后果？ 为什么湿热灭菌后不能立即排出蒸汽？ 实验二、植物病害真菌的分离、培养 一、实验目的 掌握植物病原真菌的常规分离和培养方法，为今后病原菌的分离与鉴定打下良好的基础。 二、内容、方法 1.分离的准备工作： 该工作应在很清洁的条件下进行。无菌培养室和操作箱都应很清洁。培养室可以通过蒸气或喷雾的方法清除空气中的尘埃和微生物，必要时可以喷施1/40福尔马林液消毒，(消毒后需经过一周左右才能使用)。培养室中使用前用紫外灯光灭菌30分钟，过半小时以后再入内操作。无菌操作箱可以用1/1000升汞擦洗，或喷雾或放一杯水煮沸，以除去尘埃和微生物。 2.分离材料的选择 取材应选新鲜、症状典型的病原优势部位。 3.分离方法 取出溶化后降温至80℃左右的PPA培养液，在酒精灯火焰近区拔下棉塞，将12ml培养液倒入微开的灭菌皿内，盖好平皿放桌面，水平移动5一6次，使培养液平铺皿底冷凝或平板。剪取病组织材料约0.5cm2多块，一起放人70%酒精中经2-3秒以降低表面张力，用灭菌小镊子取出转放0.1%升汞液中消毒2-3分钟，迅速取出放无菌水中换洗三次。 将小镊子灭菌后，在酒精灯火旁微开皿盖，暂屏住呼吸，用灭菌镊子小心、迅速取材料均匀摆放在培养基平板上，每皿4-5块。切忌大开皿盖或离开火焰近区。 (5)反转培养皿：放25℃温箱培养，三天后观察，如小块病组织上长出新的菌丝体即进行鉴定，确认无误后，用灭菌接种钩按无菌操作将病原转入PDA斜面上培养放25℃温箱纯化培养备用。 四、实验报告 1.?? 按小组分别完成不同的真菌病害分离工作。每人交三管培养菌种，说明分离成败原 2.?? 思考题： (1)?病原真菌的分离有哪些用途?怎样才能分离成功? (2)?真菌的分离还有哪些方法?为什么有些真菌分离需采用特殊方法和特殊基质? 第三节 植物病原真菌的单孢分离 在植病研究工作中，不论是鉴定病原，还是研究病原菌的生理、变异、毒力试验、杂交、有性繁殖等工作，都必须获得纯菌种，这样所得结果才能一致和可靠。真菌的菌种纯化方法主要有单孢子分离法和单菌丝分离法。常用的单孢子分离法有： 琼胶平板稀释纯化法、琼胶平板表面单孢子挑取法和印痕移取单孢子分离法、毛细管分离法等。 一、实验目的 学习植物病原真菌的单孢分离方法，掌握不同单孢分离方法中的关键环节。 二、内容、方法： 1.水琼胶平板的制备： 将灭过菌的3%水琼胶内加40微克链霉素/毫升灭菌、融化后，趁热倒入灭菌培养皿内9毫升左右，(厚度约2.0-2.5mm)，自然冷却凝固后待用。 2.?孢子悬浮液的配制： 用无菌水将培养的玉米大斑病菌配制成孢子悬浮液，调节制成孢子浓度为低倍镜下平均每视野有孢子1-2个。 3.?分散孢子水琼胶平板的制备： 将配好的孢子悬液按无菌操作要求，倒入凝固的水琼胶平板培养皿内，倒入量以孢子悬液淹没培养基表面为宜。静止2-3分钟后，倒出多余的孢子悬浮液。 4.试管斜面培养基的制备： 按常规方法配制PDA试管斜面培养基(内含40微克链霉素/毫升)。 5.?单孢子分离： 先将印痕器套在低倍镜头上，然后将制好的分散孢子水琼胶平板置于载物台上，移动推进器，在低倍镜下于平皿低的背面观察，当视野内仅有1个孢子并处于视野中央时，转动粗螺旋，同时在镜头侧面观察，使印痕筒刚好接触皿底面印痕，升高镜筒，培养皿底留下一个印痕时，调整好焦距，观察证实孢子的确在圆印痕中央，并且视野内确实没有第二个孢子后，移动推进器，继续寻找第二个单孢子视野，如此继续找到若干个单孢子后，取下培养皿，按印迹用灭菌的移取器将载有单孢子的培养基切下并转移到试管斜面上，放温箱内25℃恒温培养。 ?? 三天后，若病菌首先自琼胶圆片中生长说明分离基本成功，一周后进一步鉴定后，做纯化培养。 四、实验报告 1.每人分离2-3管单孢分离纯菌种，写出分离程序及结果分析。 2.思考题：