流式细胞术理论基础和应用.ppt

流式细胞术原理和应用 游东生 Beckman Coulter公司上海代表处dsyou@ CYTOME: 细胞组，包括细胞结构、亚细胞结构和细胞功能元件 CYTOMICS: 细胞组学，研究异质性细胞组的科学，特别是以生物信息学方法研究单细胞分子水平由基因、蛋白和环境引起的细胞异质性 PROTEOME: 蛋白组，指单个单位生命组分（细胞器、细胞、组织、器官乃至生命个体等）所有蛋白构成 PROTEOMICS: 蛋白组学，研究异质性生命组分蛋白组的科学，特别是由基因和环境引起的变化。 流式细胞术应用基础知识 1)认识荧光素 2)抗原抗体结合的基础和特点 3)对待测目标细胞标记物的理解－应用的背景知识 五光十色的荧光素 单分子荧光素 耦合的复合荧光素分子 新型的荧光素样荧光物质—Qdots Qdots-纳米晶体：未来的荧光素 从模拟信号到先进的数字化信号 数字化信号转换 对数查表保证最优化的线性和稳定性 4次幂转换误差 1% 光纤通讯 速度快 保真性高 实时获取数据和分析报告结果 20比特的数据，补偿数字化 全矩阵正反补偿 离线补偿 让目标细胞特异性带上荧光！！！ 1)抗原抗体结合 2)荧光素特异性结合 细胞器 生物大分子 3)生物大分子之间的结合，如 PS 与ANNEXIN V的结合 抗原抗体结合非特异性因素 抗体的交叉反应－所以最好选用单克隆抗体 FC受体与Fc段的结合 其它因素 例如： IgG-CH3与单核细胞上FcR结合； IgE-CH4与肥大细胞上FcR结合 从模拟信号到先进的数字化信号 数字化信号转换 对数查表保证最优化的线性和稳定性 4次幂转换误差 1% 光纤通讯 速度快 保真性高 实时获取数据和分析报告结果 20比特的数据，补偿数字化 全矩阵正反补偿 离线补偿 T细胞分化发育与膜表面分子的表达： CD抗原及其相关细胞群 细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞 CD105 CD106 CD109 细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126 基本原理 流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml 光路 光源 滤片 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计 计算机 流路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 μm 大小的孔径中,将细胞悬液 注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦 流动室 流式细胞仪光路图 ------单激光激发四色荧光标准模式 确保在同一个细胞上获得最多的信息 光路 - 滤片特性 长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 ，这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) 散射光信号 —— 细胞大小及颗粒性 信号 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5 FL5 - PC7 荧光信号 电压调节－利用同型对照：设置背景 荧光补偿 Need to do when we measure signals from more than 1 fluorescence. 4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5 补偿 检测的一般步骤 设置检测方案（PROTOCOL) 染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体） 同型对照管调电压 电压不变，补偿管调补偿 电压