第六章DNA和RNA的提取.ppt

核酸的提取及鉴定 二、DNA提取的几种方法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－碱裂解法 质粒DNA－煮沸法 细胞器DNA－差速离心法 （二）基因组DNA的提取－ CTAB法 （二）基因组DNA的提取－ CTAB法 （二）基因组DNA的提取－ CTAB法 （二）基因组DNA提取－ CTAB法 （二）基因组DNA的提取－ SDS法 （二）基因组DNA的提取－ SDS法 （三）基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 （三）基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： （三）基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　有机溶剂抽提法： 　　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 四、 核酸制备的一般步骤： 1、材料准备 6） 注意事项——材料准备 6）注意事项——细胞裂解 6）注意事项——核酸分离、纯化 6）注意事项——核酸沉淀、溶解 五、. DNA提取常见问题 （三）操作步骤 4.?配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌； 5.?操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换； 6.?设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 RNA提取常见问题 RNA降解 RNA降解 OD260 /OD280 比值偏低 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 DNA的定量 可采用化学的定磷法、定核酸法。 目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考： 双链DNA含量(μg／ml样品)= 0.D260nm×样品稀释倍数×50μg／ml。 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 在电泳过程中需再指示剂指示核酸迁移情况，常用的指示剂是 溴酚蓝(Bromophenol blue，Bb，蓝紫色)二甲苯蓝(Xylene cyanol，Xc，蓝色)。 溴酚蓝的分子量很小。仅670，在通常使用的不同浓度胶中电泳时近似于自由电泳，不存在分子筛效应，所以迁移速度基本相同。 二甲苯蓝的分子量仅554.6，在不同浓度胶中迁移速度也基本相同。 电泳样品中除了加指示剂外，为了使加样品能沉入胶孔，还要加入适量蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。 电泳后的核酸要经过染色才能显示出条带。 常用染色剂有溴乙锭(Ethidium bromide，TEB)吖啶橙(Acridine orange，AO)。 荧光染料溴乙锭是扁平分子，它可以嵌入核酸双链的碱基对之间，当受紫外光激发时，发射590nm的红色荧光。EB-DNA复合物的荧光比EB本身发射的荧光强许多倍。 因此一般不必洗去背景就可观察到核酸电泳带。如果背景太深条带不够清晰，可将胶浸泡于1mmol／L MgS04中1小时或10mmol／L MgCI2中5分钟，使非核酸结合的EB退色。 染色一般在电泳结束后进行，将胶浸入0.5μg／ml的EB水溶液中10分钟即可。EB见光会分解，染色时应避光。染色与电泳同时进行，只须制胶时将EB加入胶内使浓度达0.5μg／ml，这样可在电泳过程中随时观察核酸迁移情况。 在琼脂糖凝胶电泳时，用荧光染料溴乙锭染色，可检测到少至1ng的DNA。单链DNA、RNA分子中若有自身配对的双链区也可被EB分子嵌入，但嵌入量少，因而检出灵敏度较低。大于0.1μg。 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制： 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数