酿酒酵母萌发突变株的筛选.doc

酿酒酵母萌发突变株的筛选 邱盼盼 高晓冬 中西秀树 （江南大学 生工学院，江苏省无锡市 214122） 摘要：酵母细胞孢子固定化，但是由于其孢子遇到营养物质即萌发的性质，导致固定化酶的重复利用率受到限制，因此有萌发缺陷的突变株对微胶囊的应用至关重要。本文用对酵母细胞进行再经过乙醚的筛选获得株萌发突变株AN120-m5，AN120-m8，AN120-m10,和AN120-m17发现他们产孢正常，除了AN120-m5生长有些弱之外，其余三株生长都正常。后对这些突变株进行了液体培养基以及固体培养基内的验证，实验发现AN120-m10孢子在AN120-m5单个孢子在固体培养基上则完全不萌发。AN120-m5单个孢子不能萌发因此得不到杂交后代，而其余三株突变株在与野生型杂交三代后，发现野生型孢子与相比始终呈现2：2的萌发优劣比，从而可以推测，后续突变基因从而完全不萌发菌株。 关键词：酿酒酵母；萌发；；筛选 酵母细胞在缺乏氮源且遇到非发酵性碳源的情况下，酵母细胞就会进入减数分裂进行孢子生殖，将单倍体的染色体分到四个不同的子细胞中，孢子[1]。而孢子遇到营养物质如葡萄糖时，开始萌发出芽长成正常的营养细胞[] [3]。萌发是孢子经过休眠，非分裂性孢子的生长，和进入有丝分裂的过程，而控制细胞进入有丝分裂的系统是个有序的选择性系统，只有在遇到适合的情况才会退出休眠期进入有丝分裂[]，该选择性系统涉及一系列蛋白影响到转录，蛋白质的磷酸化，催化子和抑制子的稳定性 []。mannoprotein），β-葡聚糖（β-glucan），壳聚糖（chitosan），以及二酪氨酸（dityrosine）层[6] [7]，而孢子最外层的二酪氨酸层对其乙醚抗性具有重要作用[8] [9]，而正常的营养细胞对乙醚缺乏抗性，本研究利用这一特性筛选萌发缺陷型突变株[10]，建立两种新型固定化酶方法。其中一个方法是以孢子为载体[11]，利用二酪氨酸的阻挡作用酵母中分泌型的抵抗较高的温度和培养环境水解酶的降解作用酪率该强的特点 1 材料和方法 1.1材料 1.1.1菌株 出发菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）AN120由本实验室保藏和提供。 1.1.2培养基 YPAD 培养基2% 葡萄糖 2% 蛋白胨1% 酵母提取物0.003% 腺嘌呤,(固体培养基2% 琼脂)预产孢液体培养基YPACe)：2% 蛋白胨1% 酵母提取物2% 醋酸钾；产孢培养基KOAC)：2% 醋酸钾（固体培养基2% 琼脂）；萌发液体培养基YPA: 2% 蛋白胨 1% 酵母提取物0.003% 腺嘌呤; 选择性培养基：0.67% 不含氨基酸的酵母氮源，2% 琼脂2% 葡萄糖，2%不含特定氨基酸的氨基酸混合物；大肠杆菌培养基LB）：0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化钠，2%琼脂。 1.1.3化学突变试剂和缓冲液 本实验采用甲基磺酸乙酯（EMS）[]对酵母细胞进行突变，再使用5% 灭菌的硫代硫酸钠（Sigma）解除突变后的药物毒性，缓冲液使用灭菌的0.1磷酸钠缓冲液，H7.0。 1.1.4仪器与设备 移液枪）、台式高速冷冻离心机购于德国Eppendorf；光学显微镜购于美国GE公司；超声破碎仪购于南京新辰生物科技公司。 1.2方法 1.2.1突变以及乙醚筛选突变株 突变参照Fred Winston[]的方法进行，每3.0×108细胞150 μL的突变化学试剂EMS，5% sodium thiosμLfate进行解毒处理。 乙醚乙醚13%，在30℃摇床中处理45 mins 1.2.2子囊孢子的制备以及萌发步骤 在YPAD中过夜培养细胞，上述液体预产孢培养基YPACe培养24 h后，在产孢培养基KOAC中培养1~2 d，收集孢子，加入2% lyticase, 置于30℃摇床中2~3 h, 收集孢子，用去离子水洗涤两次，溶于5 m0.5% TritonX-100，使用超声破碎仪进行破壁处理5 mins，用去离子水洗涤两次。在光学显微镜下可见97%以上的细胞均为单个的孢子。萌发的步骤如下：将孢子置于YPA液体培养基于30℃下30 mins，再加入葡萄糖至总浓度为2%。萌发率的则由每100个细胞计已萌发孢子数，测三次取平均值 1.2.3四分体孢子的分离 将新鲜的孢子，置于100 μL的去离子水中，加0.5 μL的lyticase置于30℃下15 mins，将YPAD平板在边缘处划线，取10 μL的处理液置于一个线内的YPAD上，在操作台内吹干处理液，将切孢的针用乙醇处理10 mins，显微镜将四分体的孢子分离开来置于该YPAD平板上。 2结果与分析 2.1在高温下不能萌发在低温下萌发经过，处理以13%终浓度的乙醚在30℃下45 mins杀死所有的细胞，而保留一定数量的孢子存活 3 ×