重亚硫酸盐测序技术介绍.ppt

重亚硫酸氢盐直接测序技术介绍 DNA甲基化含义 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5-CG-3序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 　　DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG） 启动子的CpG岛 CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度超过200bp。在启动子（promotor）或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度相对较高的CpG对，与此段区域对应的染色体区段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的基因编码有关。 CpG岛的甲基化 CpG岛经常出现在真核生物的house-keeping基因的调控区，在其它地方出现时会由于CpG中的C易被甲基化而形成5-甲基胞嘧啶，脱氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身就会存在于DNA中，因此不易被修复，所以被淘汰。故CpG在基因组中是以岛的形式分布的。 基本原理 重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的优点。 重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点 优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列。 缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故灵敏度较MSP差。 酶切法同亚硫酸氢盐联合法 酶切法：限制性酶切后选用对特 异DNA片段甲基化序列敏感的限制性内切酶(酶 切位点与甲基化位点不重叠)进行酶切后，以待测 甲基化位点外侧序列为扩增起始点进行PCR。该 DNA片段若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若 无甲基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶切完全，否 则会出现假阳性。 酶切法同亚硫酸氢盐联合法 联合亚硫酸氢盐限制分析(combined bisul— rite restriction analysis，C0BRA) 亚硫酸氢钠可以使DNA未甲基化的C经脱氨基作用转化为u，通过随后的PcR，u将转化为T，但亚硫酸氢钠对已发生甲基化的C无上述转化作用。故此，DNA经亚硫酸氢钠处理后，进行限制性酶切CpG位点时，限制性位点的保留与否能反应该DNA片段是否发生甲基化。经电泳后电泳条带长度和强度差异观察，可以分析DNA甲基化状态和甲基化程度。COBRA集使用方便，定量准确和与石蜡切片良好的兼容性三 种特色于一身，能定量检测微量DNA样品特定基 因位点的甲基化状态，但由于涉及PCR和限制性酶 的使用，通常只能分析一个特定的序列 SSCP 将亚硫酸氢盐处理和单链构 象多态性PCR(PCR．SSCP)结合起来，设计了针对 转化后DNA序列的引物，同时扩增未甲基化和甲 基化的DNA，由此产生的两种不同的扩增产物可以 通过SSCP区分。此方法可方便地应用于任何序列的甲基化状态的分析，能对甲基化的等位基因进行半定量，获得甲基化和未甲基化等位基因的比例；并且可以提示甲基化状态的不均匀性。 重亚硫酸直接测序法对启动子测序的应用 CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构。 启动子的甲基化能抑制基因的表达。 研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。 谢谢！ * *