第三章 凝胶分离技术.ppt

第三章 凝胶分离技术;优点： 1、凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和，产物收率高，重现性好； 2、应用范围广，所分离物质分子量覆盖面大，可分离从几百到数百万分子量的物质； 3、设备简单，操作方便，周期短，可反复使用。 凝胶分离已成为一种通用的分离方法，在生物大分子物质（蛋白质、酶、核酸、激素、多糖等）的制备与生产技术中被广泛应用。;第一节 凝胶分离原理;分离原理可用下式表示： VR = V0 + kVi 式中：VR：保留体积（洗脱体积） V0：柱床内存在于凝胶外面的水相体积 ——外水体积 Vi：凝胶颗粒内部所含的水相体积 ——内水体积 k：分配系数 ; 被分离物质分子很大，被完全排阻于凝胶颗粒之外： k = 0，VR = V0 ； 被分离物质分子很小，能完全自由进入凝胶颗粒内部： k =1，VR = V0 + Vi ； 中等大小的分子，只能达到部分凝胶颗粒内部： 0 ＜k ＜1，V0＜ VR ＜ V0 + Vi。;Vo、Vi的测定 ①Vo的测定 选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积就是该柱的Vo值。 ②Vi的测定 选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积，减去Vo就是该柱的Vi 。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定。 ;分配系数k的计算： k = （VR-V0）/ Vi ;分子量与洗脱体积的关系： lgMr=-k`VR+Vo（成立？） Mr很大时，达到上限？ Mr很小时，达到下限？;二、常用凝胶 葡聚糖凝胶(dextran gel，Sephadex) 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，Bio-Gel P) 琼脂糖凝胶(agarose gel，Sepharose) 琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(Superdex) 此外还有葡聚糖醚、聚甲基丙烯酸醋、聚苯乙烯等制成的凝胶 ;1、葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶在水、醇、乙二醇、甲酸胺、二甲基甲酸胺、二甲亚枫等溶剂中都可吸液膨胀, 但吸收溶剂的量与膨胀后的体积视溶剂而异。凝胶充分膨胀的时间随交联度而不同, 交联度越小所需时间越长, 加热可以缩短吸水膨胀时间。 ;葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。 按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。 Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。 ;葡聚糖凝胶; 葡聚糖凝胶只能应用于水溶性物质与水溶液或类水溶液, 但如在葡聚糖分子上引入有机基团则可以增大其有机性质而使之呈亲脂性。如LH-20型葡聚糖凝胶即为在G-25型凝胶上引入羟丙基基团, 使糖分子与醚链相连。这种凝胶既有亲水性, 又有亲脂性, 可以在多种有机溶剂中膨胀后应用, 如氯仿、丁醇、四氢呋喃、二氧六环等, 但在苯、乙酸乙酯等溶剂中膨胀不多, 较少应用。用氯仿时,因凝胶比重较小, 所以要采取措施, 使凝胶不能浮起, 也可改用上行法。 ;2、聚丙烯酰胺凝胶 ;3、琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶与前二种不同, 它不是以化学键共价键交联的, 而是以氢键交联, 不同的孔隙程度是由改变琼脂糖的浓度而达到的,因此稳定性有一定限制。没有干的凝胶, 必须在膨胀状态保存, 遇脱水剂、冷冻和有机溶剂即破坏。pH在4-9之间、温度在0-40℃之间稳定, 超出此范围即破坏。;三、凝胶特性参数 1、排阻极限：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量，即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中，其洗脱体积为Vo。 如Sephadex G50的排阻极限为30000。 2、分级范围：即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。 如Sephadex G50的分级范围为1500-30000。 ;3、凝胶粒径：凝胶一般为球形，其粒径越小，HETP（理论板当量高度）越小，分辨率越高。 凝胶粒径多用筛目或微米表示。如软粒凝胶一般为50-150微米（100-300目），硬粒凝胶一般为5-50微米。 4、空