qPCR实验操作流程.doc

Q-PCR实验流程 ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 总RNA抽提，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，RNase free EP管中使细胞充分裂解静置5min；Trizol （Invitrogen）溶液，加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置min； 3） 4℃下，1,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；沉淀RNA：加入异丙醇，充分混匀，室温静置10min； 4下，1,000g离心10min，收集RNA沉淀4℃下，1,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清； 用75％乙醇洗两次超净台风干； 视沉淀量加入DEPC水溶解沉淀。、?（Promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。 RNA DNase ? 10 x buffer H2O(RNase free) RNasin 30 20 10 39.5 0.5 μl μl μl μl μl 总体积 μl 然后按以下步骤操作： 1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。 2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。 加入异丙醇，充分混匀，静置1min； 4下，1,000g离心1min，收集RNA沉淀，去上清； 用75％乙醇洗两次，超净台风干； 加入DEPC水沉淀。、总RNA纯度和完整性检测 纯度检测：μl RNA样品，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。 总RNA完整性检测：取RNA样品μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×0min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。 、逆转录mRNA： 在RNase freePCR管中配置下溶液otal RNA H2O 1.0 μg μl 总体积 μl  将上述溶液吹打均匀，置5℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上，以防止RNA复性； 在该PCR管中加入下试剂 oligo（dT）Random primer 10mM dNTP RNase inhibitor 5 x buffer M-MLV 0.5 0.5 2.0 0.5 4.0 0.5 μl μl μl μl μl μl 总体积 μl 将上述20μl反应溶液30保温10min； 42保温0min； 保温10mn； -20℃保存。 2. microRNA： 使用茎环逆转录法，原理如下图： 在管中配置溶液total RNA X个miR逆转录引物 H2O 1.0 0.5*X μg μl 总体积 μl  2）将上述溶液匀，5min，。随后立即冰上，以防止RNA复性； 在管中配置溶液 10mM dNTP (promega) RNase inhibitor (promega) U6逆转录引物 5x buffer M-MLV (promega) 2.0 0.5 0.5 4.0 0.5 μl μl μl μl μl 总体积 μl 将保温10minmin； 10min灭活逆转录酶。 3．正式实验： 体系配制： H2O 4ul SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀) 上游引物 0.5ul （10uM） 下游引物 0.5ul （10uM） 总体积