定点突变pcr.doc

----------------------------精品word文档 值得下载 值得拥有---------------------------------------------- ----------------------------精品word文档 值得下载 值得拥有---------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 人血管生长因子基因（hVEGF）的PCR定点突变 实验原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3 目的 学会引物的设计、PCR扩增及巩固琼脂糖凝胶电泳分析。 主要内容 1、PCR引物设计的最基本注意事项； 2、PCR扩增中的注意事项； 3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。 VEGF成熟基因序列： GgatccGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA 突变酶切位点 Ggatcc（BamH1）GAATTC（EcoR1） 引物 VEGF165-Primer-上游：5’- GAATTCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3’ VEGF165-Primer下游：5’- GCAAGCTTTTAGTCTAGACGCCTCGGCTTGTCACATC-3’ 实验步骤 1 按下列比例加入试剂 PCR反应体系如下： 试剂 终浓度 加量（25 μL） 10×Buffer 1× 2.5 μL 25 mM MgCl2 1.5 mM 1.5 μL 10 mM dNTP s 0.2 mM 0.5 μL 5 U/μL Taq 酶 1 U 0.2 μL 10 μM 上游引物 1.0 μL 10 μM 下游引物 1.0 μL 模板 0.5 μL 补加ddH2O 至25 μL 2 进行P