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免疫组织化学技术 基础医学院中心实验室 生物技术教研室 一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围 （一） 免疫组织化学技术的基本原理 免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。 1 特异性抗体的制备 先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体 2 用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体 3 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大 4 显色 由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。 5 显微镜观察、定位 通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。 组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 特异性、敏感性、定位 免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示 ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。 免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，并进行形态与功能相结合的研究。 （二）免疫组织化学技术的应用范围 近年来，随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进，特别是自70年代中期杂交瘤技术与单克隆抗体技术的引入，使制备的抗体具有高度的特异性。简便而敏感的免疫酶标技术能够用于普通培养细胞（株）、常规福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、若干年前的存档标本等，从而使该技术在生物医学研究和临床病理学、微生物学诊断中，日益显示出巨大的实用价值。 1 确定细胞类型通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结内指突状和树突状网织细胞）光镜下不易辨认，但免疫组化标记（S-100蛋白等）能清楚显示其形态。 2 辨认细胞产物利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。 3 了解分化程度大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原（EMA）着色部位在细胞膜上，但分化差的乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。 4 鉴定病变性质标记bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达；而在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达bcl-2蛋白。 5 发现微小转移灶某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。 6 探讨肿瘤起源或分化表型一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被认为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证明为神经来源（可能来自神经鞘细胞）。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通过多种标记的联合应用，也可能确定其来源。 7 确定肿瘤分期判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判断有时是十分困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。 用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别依据，同时也有治疗及预后意义。 8 指导预后和治疗免疫组化标记中与预后有关的标