巴氏小体实验报告.docx

人体性染色质体的观察实验报告一、实验目的1、掌握人体性染色质的检测方法；2、观察人体性染色质的形态特征及存在部位；为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件；3、了解雌性哺乳动物X染色体失活假说和剂量补偿效应的机制。二、背景知识二十世纪六十年代，M.L.Barr等研究发现雌猫神经细胞核膜内凝缩的深染小体[性染色质体(sex-chromatin body)或巴氏小体(Barr body)]，而雄性个体细胞中则没有。进一步研究发现：所有哺乳类雌体细胞中都可以见到这一结构。此后研究发现这种与性别有关的两型现象在有袋类、食肉类和灵长类等动物的多数组织细胞中存在，而在啮齿类中在少数组织中可以观察到。三、实验原理在雌性个体的细胞中的2条染色体，在间期，有一条呈松散状态，参加细胞生理活动；另一条保持异固缩状态，我们称之为Barr小体。由于Barr小体是处于失活状态，所以一般位于细胞核内边缘。形状多样（微凸形、三角形、卵形、短棒形等）。一般，在正常女性细胞中可能出现一个Barr小体，正常男性细胞中不可能出现Barr小体；（正常女性口腔粘膜细胞中约30－50%有一个Barr小体。在不同实验室中计数的差别较大，而在男性中则仅只偶尔可见不典型者——这是环境引起代谢的暂时现象，约2%以下）。对于性染色体畸变的个体。 Barr小体数 = 细胞内X染色体数–1。Barr小体特征及位置：它是处于失活状态的X染色体，一般位于细胞核膜内侧边缘的一个深染区（较细胞核要小），形状多样。剂量补偿效应：是指XY型性别决定的生物，由X染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。即X染色体上的基因的表达产物在雌、雄细胞中是等量的。哺乳动物X染色体随机失活或父源X染色体失活有袋动物父源X染色体失活黑腹果蝇雄性个体X染色体基因表达水平加倍秀丽线虫雌性个体两条X染色体基因表达水平减半补偿的实现途径： X染色体转录速率的差异性，雄性细胞中的X染色体转录速率＞雌性细胞中2条X染色体的转录速率；雌性细胞中有一条Ｘ染色体失活。四、实验器材、材料和试剂1、器材：生物显微镜、镊子、漱口杯、牙签、载玻片、盖玻片、染色缸、解剖针。2、实验材料：实验者的口腔黏膜或带有毛囊的头发。3、试剂：50%，70%，95%乙醇、二甲苯、5mol/LHCL、1%硫堇水溶液、蒸馏水、封固剂、乙醚、醋酸地衣红燃料或45%乙酸。五、实验步骤1、取材1）口腔黏膜材料载玻片用去污剂彻底清洗，蒸馏水彻底冲洗后再经过70%乙醇冲洗，在火焰上烘干保存备用。以防操作过程中上皮细胞脱落。取材前，自来水漱口三次，去除口腔中的细菌和已经退化的黏膜上皮细胞。防止口腔中的细菌被硫堇溶液染色与细胞发生混淆。取材时，张开嘴，用牙签轻轻刮面颊内壁，将挂下来的细胞在绝对结晶的载玻片上涂成一个占较大面积的薄层，空气中干燥30min后进行染色。2）毛囊材料取发根细胞：拔取一根带有毛囊的头发，置于载玻片上，滴加固定液于毛囊上，固定1min左右，空气干燥。2、染色1）口腔黏膜材料将涂片依次放入95%、70%、50%乙醇和蒸馏水的染色缸中，每种浓度的溶液浸泡2min。涂片自蒸馏水中取出后，放入5mol/LHCL染色缸中，大约5s。将酸解的涂片放入蒸馏水的染色缸中10-15s去算，最好重复一至两次，PH会影响染色效果。在1%的硫堇水溶液染色缸处理10-15min。染色后经蒸馏水洗后一次在下列酒精溶液中脱水：50%乙醇30s，70%乙醇30s，95%乙醇30s，无水乙醇30s。在二甲苯中透明1min，然后取出多余的二甲苯。2）发根细胞去下毛囊，弃发干，加一滴醋酸地衣红染液后盖上盖玻片，然后文火微热，静置5min后盖一滤纸压片。或者在材料上滴一滴45%乙酸或5mol/LHCL解离5min后吸掉多余乙酸。用洁净的解剖针针头将毛囊的组织分散均匀，待晾干后将载玻片放入硫堇溶液中染色20min。取出载玻片移入75%乙醇中作用30s。取出载玻片晾干待镜检。六、实验结果及分析1、镜检制片时，先用低倍镜找到细胞，再用高倍镜观察并计数性染色质体。应该注意核质是网状或细颗粒状分布；核膜清晰、核无缺损；染色适度；周围无杂菌。2、性染色质体位于核膜的内验，应为深蓝色，直径大于1um。在口腔黏膜上皮细胞中很难辨认非边缘X染色质体。3、性染色质体偶尔也在雄性细胞中观察到，概率很小。七、注意事项1、刮口腔上皮细胞前要漱口。2、涂片略干再加改良苯酚口红。3、染色时间不要太长，否则核质着色深，X染色质体不易区分。4、毛囊细胞要充分解离，压片前可先用解剖针敲片，使细胞解离。八、思考题1、掌握概念：巴氏小体、性染色质、X小体、剂量补偿效应。巴氏小体：在哺乳动物体细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体常浓缩成染色较深的染色质体，此即为巴氏小体。又称X小体，通常位于间期核膜边缘。性染色质：