PCR临床应用.ppt

PCR与基因诊断技术 基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。 Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。 概念 基本原理 以DNA为例 （1）DNA变性： （2）降温退火： （3）引物延伸： 原理 第一步 – 加热变性 预处理 第二步 – 引物与靶序列退火 第三步 - 引物延伸 第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列 30次循环后靶序列扩增的数量 荧光PCR的原理 PCR技术的特点 灵敏度高 特异性强 快速简便 应用范围广 Ct值的意义 一 感染性疾病 　 1. 病原体含量与病情之间的关系 　 2. 病原体含量与用药之间的关系 　 3. 药物及疗法的研究与开发 　 4. 新的病原体分子诊断标准 　 5. 新的愈后指标 　 6. 传染病发病的监控、预测与预防 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 一 肝炎病毒定量检测 二 性病病原体检测 三 结核杆菌及呼吸道病原体检测 四 优生优育(TORCH)相关项目检测 （一） 乙型肝炎病毒结构及特点 HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 　　　　一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 　　　　提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好 （二） HBV-DNA与“两对半” 3. 血清学指标(－)不能排除HBV感染。 HBV DNA检测的临床意义 HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎 病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性 (二)　HCV-RNA定量检测的临床意义 1. 早期诊断 a. 临床以 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。 b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。 二　常见性传播疾病病原体 一　淋球菌（NGH） 二　沙眼衣原体（ CT ） 三　解脲脲原体（UU） 四　梅毒螺旋体（TP） 五　单纯庖疹病毒（HSV） 六　乳头瘤病毒（HPV） 七　人类免疫缺陷病毒（HIV） 荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义 1. 非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。 2. 对无症状或症状轻者，可以早期确诊。 3. 对NGH、CT、UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。 4. 指导用药、考核疗效。 CT、UU、NGH、 HPV、 TP 除NGH可培养外，其余难培养或者不能培养。 即使能培养，所需时间长—48小时↑。 人乳头瘤病毒感染与致病 1. HPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主。 2. 有100多个型。 3. 低危型：HPV 6、11引起良性病变 (尖锐湿疣、喉乳头瘤等) 看看这些英年早逝的艺人，她们死于宫颈癌……宫颈癌的知晓率在不断提高。 三　结核杆菌与呼吸道病原体检测 TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia MP：Mycoplasmal pneumonia SARS：severe acute respiratory syndrome 结核杆菌流行现状（1） 罗伯特·科赫（１８４３——１９１０），德国细菌学家，结核杆菌发现者 结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现流行，且呈增长的趋势 结核杆菌流行现状（2） 我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位 2000年，全国人口结核感染率为44.5%，其中15～44岁人群占了53％ ，每年约有25万人死于结核病 结核杆菌引起的感染 肺部感染：原发性肺结核，开放性肺结核。 肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖结核、肠结核、结核性腹膜炎、全身性结核。 常规结核病实验室诊断方法及不足 1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低 、费时 2. 细胞培养“金标准”：周期