PCR详细讲解.ppt

* * * * * 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记 实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法 SYBR Green 法 工作机理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。 SYBR Green 实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理 实时荧光定量PCR 方法 2 ---------Taqman探针法 实验方法 Real Time PCR严格上可以区分为DNA起始的Real Time PCR和RNA起始的Real Time RT-PCR。 实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析 SYBR Green 法 融解曲线分析 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 非特异性产物 Cycle number Flourescenc Ck 102 Ck 104 Sample Cycle number Log of DNA concentration SYBR Green 法 定量原理 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 SYBR Green 法 ------------引物设计 SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立 反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同 SYBR Green 法 ------------PCR反应性的确认 SYBR Green 法 ------------PCR条件优化 SYBR Green 法 优缺点 对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 缺 点 荧光定量PCR的解析方法——绝对定量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 25 荧光定量PCR的解析方法——绝对定量 荧光定量PCR的解析方法——相对定量 荧光定量PCR的解析方法 荧光定量PCR的解析方法——相对定量 荧光定量PCR的解析方法——相对定量 荧光定量PCR的解析方法——相对定量 对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta Ct法更为简单。 荧光定量PCR的解析方法——相对定量 荧光定量PCR的解析方法 Comparative Delta-delta Ct法的特点 1.?Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，当优化的体系