植物组织培养实验课件.ppt.ppt

目录 实验一 MS固体培养基的制备及灭菌 实验二 外植体的灭菌及初代培养物的建立 实验三 无菌材料的继代培养 实验四 组培苗的驯化与移栽 实验一 MS固体培养基的制备及灭菌 一、 实验目的 巩固培养基相关理论基础知识，掌握培养基制备方法及灭菌技术 二、材料、试剂与用具 配制MS培养基母液所需要的药品、琼脂粉、蔗糖、蒸馏水、95%的酒精或0.1mol/L的NaOH、0.1mol/LHCl。 各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、母液瓶、标签、冰箱。 三、方法步骤 1、母液的配制（1）母液1的配制称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。NH4NO3 8.25g， KNO3 9.5g，MgSO4H2O 1.85g混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合。定容：加蒸馏水定容至1000ml成50倍液。 （2）母液2的配制称量：用电子天平称取CaCl2.2H2O22.0g。定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液 （3）母液3的配制称量：用电子天平称取KH2PO48.5g定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。 （4）母液4的配制称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。Na2-EDTA 1.85g FeSO4.7H2O 1.39g混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解后混合。定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。 （5）母液5的配制称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。H3BO3 0.31g，NaMoO4·2H2O 0.0125g，MnSO4·4H2O 1.115g， CuSO4·5H2O 0.00125g，ZnSO4·7H2O 0.43g CoCl2·6H2O 0.00125gKI 0.0415g混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合。定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。 （6）母液6的配制称量：用电子天平称取下列药品，分别放入烧杯。肌醇 5.0 g VB6 0.025g 甘氨酸 0.1gVB1 0.005g 烟酸 0.025g混合：用少量蒸馏水将药品分别溶解后混合。定容：加蒸馏水定容至500ml成100倍液。 （7）植物生长调节物质母液的配制称量：用电子天平称取生长素或细胞分裂素50-100mg。溶解：生长素用少量95%的酒精或0.1mol/L的NaOH溶解，细胞分裂素用0.1mol/LHCl加热溶解。定容：加蒸馏水定容至100ml配制成0.5-1mg/L的溶液。(8) 装瓶：将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，注明培养基名称、母液倍数与配制日期。 2、 MS固体培养基的配制、分装和灭菌 称取一定量的琼脂和蔗糖，加入蒸馏水（目标体积的2/3左右）电磁炉上加热；取出母液按顺序放好，量取适量的各母液（根据情况事先在烧杯中加200-500ml蒸馏水），待琼脂蔗糖完全溶解后加入，继续加热至沸腾；定容至目标体积；调整pH值到5.8；分装到培养瓶中，封口；121℃高温高压灭菌20分钟；取出放到洁净的房间凝固后备用。 四、实验报告 将本次实验内容整理成实验报告并探讨培养基配制过程需要注意哪些问题。 实验二 外植体的灭菌及初代培养物的建立 一、 实验目的 通过外植体灭菌处理、超净工作台上外植体接种等无菌操作训练，掌握植物组织培养材料灭菌的基本方法及无菌操作技术，建立无菌培养体系。 二、材料、试剂与用具 1、材料：植物的茎、叶、种子等。2、仪器：超净工作台、显微镜、解剖刀、刮皮刀、不锈钢打孔器、长镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等。3、试剂：培养基（MS+10mg/L2，4-D+2mg/L6-BA）、70%乙醇、饱和漂白粉溶液。 三、实验步骤 1、材料的选择 选用健壮、无病虫害的枝条、晴天近中午取材。 2、材料的灭菌 选取长约10厘米的苹果嫩枝条于饱和漂白粉溶液或 0.1%的升汞溶液中表面消毒15分钟，然后用无菌水冲洗3次。 3、无菌接种操作 用剪刀将灭菌后的枝条剪成1-1.5厘米长的小段，接种于培养基上，形态学下端在下。 4、培养条件的设置 培养物置于25℃左右的培养室中，每天光照12小时，光照度为850-1200lx。 四、实验报告 将本次实验内容整理成实验报告并探讨外植体灭菌不彻底的可能原因有哪些。 实验三 无菌材料的继代培养 一、 实验目的 进一步熟悉无菌操作的过程，为后续实验培养植物材料。 二、材料、试剂与用具 1、材料：植物组培苗。 2、仪器：超净工作台、长手术剪、长镊子、烧杯（500ml）、培养皿等。 3、试剂：培养基