卡介菌纯蛋白衍生物.docVIP

卡介菌纯蛋白衍生物 Kajiejun Chundanbai Yanshengwu Purified Protein Derivative of BCG (BCG－PPD) .3菌种接种和培养 挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他培养基的表面，置37～39℃静置培养8～10周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，必须废弃。 2.2.4收获及杀菌 培养终止，将培养物于121℃30分钟杀菌，过滤除去菌膜及菌体。如滤液需保存，应加入3.0g/L苯酚或其他适宜的防腐剂，于4～8℃保存，保存期不超过30天。 2.2.5 纯化 收集滤液进行纯化。用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，采用经批准的方法纯化，除菌过滤后即为原液。 2.2.6合并及冻干 2.2.6.1合并 将不超过5次纯化的原液进行合并。 2.2.6.2分装及冻干 原液检定合格后，可根据蛋白质含量，将原液稀释至规定浓度，定量分装，分装后立即冻干。 2.2.7原液检定 按3.1.1项进行。 2.2.8保存及有效期 原液应于2～8℃保存。液体原液自效价测定合格之日起有效期为5年；原液冻干品自效价测定合格之日起，每隔5年应按3.1项进行检定，合格后可继续使用。 2.3半成品 2.3.1 配制 经检定合格的原液，用0.01mol/L PBS（pH7.2～7.4，含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚）稀释至50IU/ml。稀释时充分摇匀，并逐瓶做无菌检查（附录Ⅻ A） 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品制备 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3规格 每瓶1ml、2ml。每1次人用剂量为0.1ml，含BCG-PPD 5IU。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3 检定 3.1原液检定 3.1.1外观 原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体，无不溶物或杂质。 3.1.2复溶时间 冻干品按标示量加入注射用水后，应于3分钟内完全溶解。 3.1.3水分 应不高于3.0%（附录Ⅶ D）。 3.1.4纯度 3.1.4.1蛋白质含量 依法测定(附录Ⅵ B第二法)。 3.1.4.2多糖与核酸含量 每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg。 （1）多糖含量测定：以生理氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0～100μg/ml葡萄糖标准溶液。取硫酸225ml加入到75ml生理氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.6g加入10ml乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度葡萄糖标准溶液及本品，加入4.0ml蒽酮混合液，混匀，置沸水浴20分钟后于波长620nm 处测定吸光度，以葡萄糖标准溶液浓度对应其吸光度，用minitab或其他统计学方法求回归方程，代入本品吸光度，计算多糖含量。 （2）核酸含量测定：取本品2～3 ml，采用紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A），于波长260nm处测定吸光度，按E1% 1cm=200计算核酸含量。 3.1.5效价测定 3.1.5.1动物法 将标准品及本品分别稀释3个不同的适宜稀释度，至少取4只已经卡介菌致敏的体重为400～600g的白色雌性豚鼠，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度本品各0.1ml或0.2ml，于注射后24小时、48小时各观察局部硬结的纵径与横径（可根据48小时的反应结果判定），计算每个稀释度2天的硬结反应总和或平均面积，并求其比值，每个稀释度本品与相应浓度标准品的比值应为0.8～1.2,如不符合上述要求，可调整稀释度后再测定效价，直至符合要求。 3.1.5.2稀释度选择 稀释度的选择应能使本品注射后24小时所产生的局部硬结反应直径为8～25 mm；本品和标准品的反应直径大小应相似，且本品和标准品的3个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。若本品效价与标准品效价不一致，可用同样方法复试1次，并算出相当于标准品的效价，进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至符合要求。 3.1.6无菌检查 依法检查（附录Ⅻ A ）应符合规定。 3.1.7无有毒分枝杆菌试验（取消动物法） 取1.0ml本品，分别接种于10支罗氏鸡蛋培养基,37℃培养4周,应无分枝杆菌生长。 3.1.8致敏效应试验 试验组与对照组分别用体重300～400g未做过任何试验的豚鼠各3只，试验组每只豚鼠皮内注射0.1ml含500IU的本品，共3次，每次间隔5天。在第3次注射后15天，试验组与对照组豚鼠各皮内注射0.1ml含500IU的本品，连续观察3天，两组动物反应应无明显区别。 3.2半成品检定 无菌检查 依法检查（附录Ⅻ A），应符合规定。 3.3成品检定 3.3.1鉴别试验 取已经卡介