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实验四 沉淀反应 双向扩散与免疫火箭电泳 实验课重点 掌握： 1.双向免疫扩散实验手工操作过程 2.火箭电泳原理及影响因素 熟悉： 1.双向免疫扩散实验结果分析 2.火箭电泳实验操作过程 试剂与器材 1.抗原：人血清 2.抗体：抗人IgG血清 3.生理盐水（1：2~1：64系列倍比稀释） 4.用生理盐水和琼脂粉配成1.1%的琼脂 5. 5*5cm的洁净培养皿 6.水浴箱，锥形瓶，打孔用小吸管移液器和酒精灯等 实验一主要步骤 琼脂加热 制琼脂板 37度24小时 打梅花孔 加血清与抗血清 观察结果 实验一注意事项 1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在1~1.5mm（视线要在平皿侧面观察）。 2.打孔时要等琼脂完全冷却后，垂直打孔。 3.用针挑去孔内琼脂时要小心损伤孔边缘。 4.孔内加样要准确，不得使加样头碰到琼脂孔边缘。 5.平皿要始终水平操作。 结果分析 A.Ag、Ab浓度及分子量相近；B. Ag、Ab浓度相近，分子量AgAb; C. Ag、Ab浓度相近，分子量AgAb;D.浓度AgAb,分子量相近; E.浓度AgAb,分子量AgAb;F.浓度AgAb,分子量AgAb 试剂与器材 1.抗原：人血清 2.抗体：抗人IgG血清 3. 水浴箱，锥形瓶，移液器等 4.琼脂糖电泳槽 5.PH8.6巴比妥缓冲液 实验二主要步骤 PBS混合琼脂55℃ +抗血清 制琼脂电泳玻璃板 电泳槽加PH8.5PBS 取点样梳 电泳5~6小时 梳井内加血清 观察结果 1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG相反方向的电渗作用。 5.加样和琼脂中抗血清的浓度。 定量结果判断 1.将待测电泳峰高度与1、2、3标准浓度血清对比得出浓度。 2.将标准血清浓度与峰值高度绘制曲线图，根据待测电泳峰高度，查处相应浓度。 实验二注意事项 1.琼脂要充分加热，倒板是要迅速且厚度掌握在1~1.5mm，倒满整个玻璃挡板范围内。 2.要等琼脂完全冷却后，先从一侧慢慢取下点样梳。 3. 加样要准确，要加到梳井孔内。 4.悬空加样，通电后不得用手触及电泳环境中的缓冲液。 5.电泳一段时间后注意观察火箭沉淀现象。 火箭电泳应用的意义 火箭电泳作为抗原定量只能测定ug/ml以 上的含量，低于此水平则难以形成可见的沉 淀峰，若是使用少量125I标记抗原或抗体，即使 含量低火箭峰不可见也可使用X线胶片显影的 技术显示火箭峰，测出ng/ml的含量浓度。 思考题 火箭电泳实验结果不好,常会有哪些影响因素,分别造成什么样的电泳图? 实验报告 实验一 1.实验报告标准格式 2.梅花孔图文描述（抗原与抗体复合物位置、形状及代表意义；抗体效价浓度比例） 实验二 1.实验报告标准格式 2.火箭形状描述，失败或结果不好的原因 3.定量结果（与3个标准血清峰比较大致含量） 以上均以书面和图形表示在实验报告中 实验标本分类 实验一 1.美国贝克曼羊抗人血清igG试剂（每个大试验台2支子弹头）共8支 2.人血清标本（每个大试验台2支子弹头）共8支 3.5*5平板每人一个共56个 4.打孔吸管和挑取针（每个大试验台3附） 5.琼脂锥型瓶4个（每个大试验台1个） 实验标本分类 实验二 1.人标准血清1，2，3，和标本血清1，2，3，4，5共四份全体实验学生共同配合使用。 2.火箭电泳漕两个，课堂由学生制作电泳琼脂板四个。 3.四块电泳琼脂板分四个大实验台学生自行加样跑电泳。整组统一操作，每组一名组织人。 * *  实验一、双向扩散实验 原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。 技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5 mm之间，在相对的孔中加入10ul血清与抗血清，放置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周围是否出现沉淀环。 鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 双向扩散试验 （平板法） 应用 1.抗体效价的滴定 2.抗原或抗体纯度 的鉴定 双向扩散试验 （平板法） 电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合