1-2陈焕程基因工程的基本操作程序.ppt

(二)利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术扩增与DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原理 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： （三）人工合成的目的基因 4、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个 B 1000个脱氧核苷酸对，即2000个核苷酸。 由于A=T=460个，所以，C=G=540个。 所以，一个目的基因有胞嘧啶脱氧核苷酸540个。 扩增4代可产生16个DNA分子，根据DNA半保留复 制原则，其中有一个DNA分子“相当”于亲代的DNA。 所以，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸数为 （16-1）*540=8100个。 5、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法? ? B、基因组文库法 C、cDNA文库法?? D、聚合酶链反应 6、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③ A D 二、基因表达载体的构建——基因工程的核心 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2、表达载体的组成 启动子 终止子 目的基因 标记基因等 它们各自的作用是什么? 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。 质粒 DNA分子 限制酶处理 二个切口 两个黏性末端 四个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 3.过程: ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 注意 启动(终止)转录 启动(终止)翻译 作用 位于DNA上 位于mRNA上 位置 DNA片段 三个相邻碱基 本质 启动(终止)子 启始(终止)密码子 三、将目的基因导入受体细胞 （一）转化： （二）方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——感受态细胞 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 ②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 ③过程： ④优点 （2）基因枪法 （3）花粉管通道法 2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序： 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 ①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法： 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 四、目的基因的检测与鉴定 ——检