黄芩指纹图谱的建立.doc

第二章 黄芩指纹图谱的建立 1 样品的收集 黄芩主产于河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林等地，以栽培品种为主，只有少量野生品种。本课题从全国八个省区（山东、内蒙古、甘肃、河北、安徽、山西、陕西、吉林）共收集到黄芩样品100批（详细情况见附录3）。 2 样品前处理方法 对收集到的各批黄芩样品，均按照中国药典2010年版一部附录ⅡA项下药材取样法，四分法取样，1/4留样，剩余粉碎，分为20～60目和过60目筛的粉末并分别称重。 所有黄芩样品均装袋密封，保存于冰柜（-20℃）中，备用。 3 样品供试液制备方法[46] 3.1 取样方法 按比例称取20～60目和过60目筛黄芩粉末。 3.2 样品供试液提取条件的确定 临床上黄芩多用水煎内服的用法，因此确定以水作为提取溶媒。为了防止提取过程中苷类成分发生酶解反应，采取了先向样品中加入沸水，然后再微沸提取40分钟，每隔10分钟振摇一次的提取方法。 3.3 内标物的确定 自山奈酚、槲皮素、葛根素、芦丁中筛选黄芩HPLC指纹图谱测定内标物，结果只有葛根素的出峰位置合适，且与黄芩组分色谱峰有较好分离度，所以选择葛根素作为内标物。测定结果见图1。 黄芩样品 山奈酚 槲皮素 芦丁 葛根素 黄芩加葛根素 图1 选择内标物的HPLC图谱 3.4 内标物溶液浓度的确定 随机选取5个黄芩样品，以制备样品溶液，并加入等体积不同浓度的内标溶液，混匀，高效液相色谱仪测定，以确定葛根素的浓度，使该浓度下葛根素的峰面积适中。确定葛根素对照品溶液浓度为100μg/ml。 3.5 内标物溶媒的确定 由于向黄芩样品溶液中加入含甲醇的内标溶液，可能会引起样品溶液的醇沉反应，遂作对比试验：取三份相同的黄芩样品溶液，标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别加入等体积不同溶媒的内标溶液，摇匀，静置，观察样品是否澄清。结果见表1。 表1 内标物溶媒选择的观察结果 样品溶液 内标液溶媒 0h 2h 12h 24h Ⅰ — 澄清 澄清 澄清 澄清 Ⅱ 30%甲醇 澄清 澄清 浑浊 出现沉淀 Ⅲ 水 澄清 澄清 澄清 澄清 根据以上试验结果，确定以水作为葛根素内标溶液的溶媒。 3.6 样品供试液的制备 自冰柜中取出黄芩粉末样品，放至室温。采用四分法，按比例精密称定20～60目和过60目筛的黄芩粉末，共1.5g，精密加入60ml沸水，称定重量后加热提取40min，每10分钟振摇一次，取出放至室温，用蒸馏水补足失重，离心（转速2500r/min）15min，上清液用0.45μm的微孔滤膜滤过，初滤液弃去，精密量取续滤液和内标物溶液各0.5ml用于高效液相色谱指纹图谱测定，其余续滤液供药效试验用。 4 色谱指纹图谱测定方法[46] 4.1 仪器与试剂 Agilent 1200 series高效液相色谱仪；Waters高效液相色谱仪（600四元梯度泵，996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站）。 甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。 4.2 色谱条件的考察 4.2.1 流动相的选择 采用Kromasil C18（江苏汉邦科技公司）色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长280 nm；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。分别以甲醇-0.25% 甲酸、乙腈-0.25%冰醋酸、乙腈-0.25%甲酸、乙腈-0.3%磷酸作为流动相，按表2-1，2-2的规定进行梯度洗脱。结果见图2。 表2-1流动相选择试验表 流动相1 流动相2 时间(30min) 0.25%甲酸 甲醇 时间(30min) 0.25%甲酸 乙腈 0 87 13 0 85 15 25 80 20 30 75 25 45 70 30 45 70 30 55 60 40 50 60 40 65 40 60 55 60 40 70 30 70 60 40 60 75 30 70 65 30 70 76 87 13 66 85 15 80 87 13 70 85 15 表2-2 流动相选择试验表 流动相3 流动相4 时间(30min) 0.25%冰醋酸 乙腈 时间(30min) 0.3%磷酸 乙腈 0 85 15 0 85 15 30 75 25 30 75 25 45 70 30 45 70 30 50 60 40 50 60 40 55 60 40 55 60 40 60 40 60 60 40 60 65 30 70 65 30 70 66 85 15 66 85 15 70 85 15 70 85 15 流动相1 流动相2 流动相3 流动相4 图2 流动相的选择 结果表明，乙腈-0