06实验六酵母醇脱氢酶的提取、纯化和活性分析.ppt

实验六 酵母醇脱氢酶的提取、纯化 和活性测定 实验目的 掌握酵母醇脱氢酶的提取、纯化、浓度测定和酶活性测定的原理和方法。 实验原理 分离纯化： 用热变性、有机溶剂沉淀等方法，从酵母中提取一定纯度的醇脱氢酶。 CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+ 乙醇过量时，NAD+被还原成NADH的速度与酶活力成正比，NADH在340 nm有较强吸收，可测定单位时间内NADH的生成量，确定酶的活力。 醇脱氢酶 醇脱氢酶 催化醇和醛之间的氧化还原反应，辅酶是NAD+/NADH。 实验步骤 一、提取纯化酵母醇脱氢酶 （一） 粗提 酵母2.00 g，半勺石英沙和Na2HPO4溶液5.0 mL，研磨10 min，转入50 mL离心管。用20 mL Na2HPO4溶液洗研钵，转入离心管，混匀，5000 rpm离心5 min。取上清液，量取体积V1 ，从上清中取2个1.0 mL，分别加入1.5 mL离心管，4℃保存（用于测蛋白浓度和酶活力），剩余的上清液继续下一步纯化。 （二）热变性去除杂蛋白 剩余的上清在55℃保温15 min，冰浴冷却，5000 rpm离心5 min，取上清，量体积V2 ，取2个1.0 mL分别加入1.5 mL离心管中（用于测蛋白浓度和酶活力）， 4℃保存备用，剩余的上清置冰浴中。 （三） 有机溶剂沉淀杂蛋白 将上清体积一半的预冷丙酮加入上清中，混匀， 4℃静置15 min ，5000 rpm，离心5 min，取上清，量体积V3，取2个1.0 mL分别加入1.5 mL离心管中，4℃保存备用（用于测蛋白浓度和酶活力），剩余上清转入预冷的50 mL离心管。 （四） 有机溶剂沉淀酶蛋白 按100 mL上清液加55 mL丙酮的比例，加入预冷的丙酮，混匀，静置15 min，4℃，5000 rpm离心5 min。弃上清，沉淀溶于5 mL 0.01 mol/L K2HPO4中，体积为V4，取2个1.0 mL分别加入1.5 mL离心管（用于测蛋白浓度和酶活力） 。 1. 将每步保存的上清分别用0.01mol/L K2HPO4稀释10倍 2. 另取4只试管，编号，分别加入以下4种试剂 3. 逐管加入0.20 mL稀释后的酶液，混匀后立即测定A340 3.0 mol/L乙醇 0.1 mL 0.06 mol/L 焦磷酸钠 0.5 mL 0.0015 mol/L NAD+ 0.3 mL 蒸馏水 1.6 mL 二、酶活力的测定 样品编号 A340/min 1.0 mL酶原液的酶活力(U/mL) V1 V2 V3 V4 酶液加入体积：0.20 mL 酶液稀释倍数：10 1.0 mL酶原液的酶活 = A340×1000×10/0.2 酶活定义：每分钟A340增加0.001定义为1个单位。 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，最大吸收波长595 nm，在0-100 μg/mL范围内，吸光度与蛋白质的浓度成正比。 蛋白质与G-250反应在2 min内达到平衡，且稳定，可检测微克级的蛋白质。 三、蛋白质含量测定（Bradford法） 1.蛋白质标准曲线的制作 蛋白质标准液（牛血清白蛋白）：100 μg/mL 管号 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（mL） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水（mL） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 G-250染液（mL） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 蛋白质含量（μg） 0 10 20 30 40 50 A595 测定值 2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 取4种样品提取液稀0.5 mL，释50倍（推荐值），混匀，各取1.0 mL放入PA瓶，加3 mL G-250染料，混匀，放置2 min，在595 nm比色，记录吸光度值，通过标准曲线计算蛋白质的含量。 四、计算 （按照测定的数据完成下表） C= A×B，E=A×D，F= D/B（或E/C） 提纯步骤 总体积(mL) A 蛋白浓度 (mg/mL) B 蛋白总量(mg) C 1 mL酶活力（U） D 总活力 (U) E 比活力 (U/mg) F 回收率（%） 蛋白 G 活力 H 粗提 22.5 1.986 44.6 1450 32625 731.5 100 100 热变性除杂 19.2 1.15 22.