分子生物学的研究方法-DNA-蛋白质相互作用.ppt

第六节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法 凝胶阻滞试验方法 凝胶阻滞试验用途 2.6.2 DNasel足迹试验 DNasel足迹试验过程 足迹试验的优点 DNasel足迹试验发展 2.6.3 甲基化干扰试验 甲基化干扰试验的具体操作 甲基化干扰试验的用途 DMS化学干扰的主要局限性 2.6.4 体内足迹试验 体内足迹试验的方法 体内足迹试验优缺点 思考题 * 基因工程 第二章 基因工程技术原理 * 西北师范大学 第五章 分子生物学研究的主要方法 ---生命科学院分子生物学 又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相在缩短了。所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。 2.6.1 凝胶阻滞试验 原理 返回目录 返回第二章 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段（亦称探针DNA），然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA一蛋白质复合物。将它加样到非变性的凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离，并应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞层白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标己都将集中出现在凝胶的底部；反之，将会形成DNA一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以有的文献中也称这种试验为条带阻滞试验（band retardation assay）。 鉴定特殊细胞提取物中，是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质分子（比如特异的转录因子等） 研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性：其办法是在DNA一蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA。如果竞争同一种蛋白，由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA处于自由状态，自显影图片上不出现阻滞的条带，相反，如果不竞争同一蛋白，探针DNA仍与特定蛋白复合，呈现阻滞的条带。 使用竞争DNA，可间接阐明体内的DNA与蛋白质的相互作用。如，使用一种具有与已知转录因子结合位点的竞争DNA，就可以判断检测到的蛋白质是否属于此类转录因子，或是与之相关的其它转录因子；如果事先引入突变，可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响。 尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA蛋白质之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部位。要解答这个问题，则需要应用 DNasel足迹试验（footprinting assay）。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。 首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链DNA分子 体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的 DNasel（它可沿着靶 DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNasel消化之后便会产生出距放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。 从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹” 。 可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹试验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核酸序列的特异性。