Hoechst33258染色(综合).doc

Hoechst 33258染色 【原理】 Hoechst 33258，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式为C25H24N6O · 3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258 为特异性 DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定的细胞可立即染色。而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。【试剂与器材】 1. Hoechst 33258 贮存液： 称取 Hoechst 33258 试剂 1mg ，用 20ml 蒸馏水溶解后，滤过， 4℃ 避光保存。用时蒸馏水 10 倍稀释成染色液。用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10微克/毫升 2. 封片液（ pH5.5 ）： 20mmol/L 柠檬酸； 50mmol/L 磷酸氢二钠； 50% 甘油， 长春新碱 3. 细胞固定液 甲醇、冰乙醇（ 3∶1 ），现配【操作步骤】 贴壁细胞 ，让细胞自己在盖玻片上爬片。操作如下：A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。 B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4过夜）。 C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液(5mgL)，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。,在荧光(检测波长360nm,参比波长450nm ) 显微镜下观察, 并随机拍照。G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱 2. 悬浮细胞 A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4过夜）。 B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。 C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。 D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 3. 组织切片 A. 常规包埋切片后，脱腊，透明。 B. PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。 C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。 D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 E. 将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。如果荧光显微镜是倒置的，就不用爬片，可以直接固定，染色，观察。不是倒置的无法直接看，爬片后，倒盖在波片上，显微镜才可以看。主要是看显微镜的类型问题【】 4°C储存最多可达6个月。-20℃避光保存，一年有效。 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。注意：Hoechst 33258可能致癌或突变。戴手套和面罩，在通风厨中使用。μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml，20 μg/ml剂量组，6孔板（1×105/孔）细胞贴壁后加药培养48小时，离心弃上清，加入PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10min, PBS洗2次,用Hoechst 33258(5mg/L)染色5min,再用PBS洗2次,室温下晾干,在荧光(检测波长360nm,参比波长450nm