第十章：分子生物学研究方法.ppt

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶。这种酶是1970年美国科学家特明和巴尔的摩分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。 该酶具有依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链。 RT-PCR反应的主要成分和作用 RT的引物 随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 Oligo（dT）：适用于具有PolyA尾巴的RNA（原核生物的RNA、真核生物的 rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴）。由于Oligo（dT）要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少. 基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 分离高质量RNA 提高RT-PCR灵敏度 28S RNA 18S RNA 5S RNA 260nm --- 核酸 320nm --- 背景（溶液浑浊度) 230nm --- 盐浓度 280nm --- 蛋白质等有机物 OD260/OD280（R）= 1.8～2.0 R1.8 --- 溶液中存在蛋白质等有机物的污染 R2.2 --- RNA 已经被水解成了单核苷酸 RNA 浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl。 不同的逆转录酶合成cDNA的能力不同 cDNA总量 全长cDNA总量 原因在于其中的RNase H活性的强弱。 使用无RNaseH活性的逆转录酶 提高逆转录酶保温温度：较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。 PCR反应产物 减少基因组DNA污染 可在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。 设计对照实验鉴定是否存在DNA污染。 DNA cDNA Exon 1 Exon 2 引物 反向PCR（inverse PCR） 用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。 多重PCR（multiplex PCR） 多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增。 概念 在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高度特异性。 技术难点 应用 应用于基因诊断，对与疾病相关的基因（庞大）进行扩增检测。 DNA、cDNA 及其微量的模板就可用于扩增。 PCR技术的具体操作 模板的制备 掌握PCR引物设计的原则 引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。 PCR?引物设计 掌握引物设计的方法 手工设计和计算机软件设计引物：以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列。 5’-ATTAGGCACGGT CTATTGGGCAA-3’ 5’-ATTAGGCACGGT GATAACCCGTT-5’ 5’-TTGCCCAATAG Primer 1 Forward primer Primer 2 Reverse primer PCR扩增的基本方法 PCR反应的成分和作用 无Mg2+?buffer（Mg2+ free）：PCR反应的缓冲液：由纯水、KCl、Tris组成。其目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催化反应条件。 BSA：有助于酶的稳定。 Mg2+?：Taq 酶具有 Mg2+依赖性。 底物（dNTPs） 引物：浓度一般为0.1～0.5μM，过高会引起错配和非特异扩增，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低；浓度过低则得不到产物或产量过低。 引物二聚体 Taq酶---不同的DNA polymerase活性不同，可依据实验的目的选择不同的酶。 模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质。存在过高：非特异产物增加；过低：产量降低。 从人基因组DNA中扩增出的15kb的大片段tPA基因， M---分子量标准， 1---25ng模板； 2---5ng模板； 3---1ng模板。 PCR反应条件的选择（影响因素） 94℃ 2~5 min