第四讲DNA分子的酶切.pptx

植物基因工程原理与技术 主讲：刘金灵 湖南农业大学农学院 Table of Contents 本讲内容 基因工程工具酶 基因工程工具酶 指在分子水平上进行基因工程操作时，使用的有助于操作完成的酶类,如限制性内切核酸酶、连接酶、聚合酶等。酶的本质是蛋白质。 工具酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特一序列，切割DNA。 DNA连接酶 催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。 DNA聚合酶I 合成双链cDNA的第二条链。 缺口平移制作高比活探针。 DNA序列分析。 填补3’末端。 反转录酶 合成cDNA。 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析。 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5’羟基末端磷酸化，或标记探针。 末端转移酶 在3’羟基末端进行同质多聚物加尾。 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基。 重组DNA常用工具酶 2.1限制性核酸内切酶概述 2.2限制性核酸内切酶的类型 2.3限制性核酸内切酶的命名 2.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 2.5 Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 2.6影响限制性核酸内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶 是一种存在于细菌体内的，能在特异的酶切位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段，又称为“分子手术刀”。 2.1限制性核酸内切酶概述 限制性内切酶切割DNA示意图 EcoRI KpnI SmaI EcoRI KpnI SmaI CK CK 核酸酶分类 核酸酶 核酸外切酶与内切酶 从核酸分子链条末端顺次水解磷酸二酯键，而将核苷酸切开，生成单核苷酸的酶。 从核酸分子链内部水解磷酸二酯键，而将核酸链切断，生成寡核苷酸链的酶。 核酸酶切割方式 C G TTA C G AAT C GGT A 核酸外切酶 核酸内切酶 核酸外切酶 限制性内切酶切割DNA的机制 I性 II型 III型 2.2限制性核酸内切酶的类型 三类限制性核酸内切酶特性比较 特性 I型 II型 III型 限制性修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+SAM Mg2+ ATP Mg2+SAM 识别序列 特异性、非对称 特异性、旋转对称 特异性、非对称 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游24-26bp处 切割方式 随机切割 特异切割 随机切割 2.3限制性核酸内切酶的命名 基本名 系统酶名称：限制性核酸内切酶的系统名称为R，甲基化酶为M。 如R.HindIII表示限制性核酸内切酶，相应甲基化酶用M.HindIII表示。 限制性核酸内切酶命名示例 (流感嗜血杆菌d株I) Haemophilus influenzae d I 2.4Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 Ⅱ型限制性核酸内切酶的用途 Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列 EcoRⅠ：5’…GAATTC…3’ 3’…CTTAAG…5’ HindII：5’…GTYRAC…3’ 3’…CAYRGT…3’ 严格专一型 非严格专一型 （Y: C/T，R: A/G） Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列 NotⅠ： 5’…GCGGCCGC…3’3’…CGCCGGCG…5’ XcmⅠ：5’…CCANNNNNNNNNTGG…3’3’…GGTNNNNNNNNNACC…5’ Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列 6个碱基切割频率=46=4096 Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式 大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶均在识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。 三种类型切割方式 酶切产生平头末端 酶切产生5’突出黏性末端 -C-T-G-OHG … 3’ -G-A-C-T-T-A-A-P P-A-A-T-T-C-G-A-’ OH-G-C-T- 3’ 5’ 酶切产生3’突出黏性末端 P-G-G-A- H-A-C-G-T-C-C-T- G-C-T-C-T-G-C-A-OH -G-A-G-P 5’ 3’ 限制性内切酶切割DNA的结构机制 常用的部分限制性内切酶 练习：质粒DNA酶切 请用XhoI对该质粒进行酶切，可以切成多少个片段？每个片段大小是多少？ 两种特殊的限制酶 HpaII (C↓CGG) MspI(C↓CGG)/(Cm↓C GG) BamHI (G↓GATCC) BglII(A↓GATCT) 常见同裂酶列表 同尾酶切割后连接 同尾酶切割后连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的酶再进行切割。 常见同尾酶列表 2.5II型限制性核酸内切酶反应的条件 DNA模板 内切酶 缓冲液 ddH2O 限制性内切酶单位 在合适的温度和缓冲液中, 20/50µl反应体系中，反应1小时，完全水解1µg标准DNA所需的酶量。 1个活性