《现代分子生物学》第九讲分子.ppt

第九讲 分子生物学研究方法 （三）RNA研究技术 （四）蛋白质研究技术 本章主要内容： 1、分子生物学常用试剂； 2、SNP理论及应用； 3、RNA研究技术及应用； 4、蛋白质分离与纯化。 核酸分子杂交及检测 （续） 5、原位杂交 用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。 原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。 原位杂交的原理 原位杂交的应用： 染色体分析 显微、亚显微水平的基因表达定位 病原的检测 转基因的检测 三、SNP的理论与应用 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，G，C，T）插入、缺失、转换和颠换等而引起的多态性。 SNP与疾病 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（single nucleotid polymorphism SNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。 SNP应用 人类基因单体型图的绘制; 绘制人类基因单体型图，描述人类常见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联SNPs的区域。 SNP与疾病易感基因的相关分析; 遗传标记的频率在患者中明显超过非患者时，就表明该标记基因可能与这种疾病相关。 指导用药与药物设计; 通过研究SNPs与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的影响，对患者施行个性化用药。 四、基因芯片技术 基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。 基因芯片 DNA芯片，又称基因芯片(Gene chip)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统等对芯片的杂交信号进行量化，得出所要的信息。 特 点－－微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理感兴趣的生物样品，精细地研究组织细胞基因表达情况，了解各种状态下分子结构变异和分子病理过程，并为寻找合适的医药或疫苗。 实 验 设 计 疾病发展过程 RNA分析技术 一个典型的哺乳动物细胞中含有约10-5μg RNA，其中80-85%是核糖体RNA ，剩余的15%-20%中大部分由不同的低相对分子质量的RNA组成（如转运RNA 和小核RNA）。 因为核糖残基在2’和3’位带有羟基，所以RNA比DNA的化学性质更活跃，易于被污染的RNA酶—具有水解核糖残基和磷酸间二酯键能力的酶切割。 一、RNA基本操作技术 常用的RNA分析方法： （1）PCR: RT-PCR（Reverse Transcription PCR, Real-time RT-PCR （2）原位杂交（In situ hybridization） （3）Northern Blot （4）RNA interference RT-PCR 原理：提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用olig-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。 应用：分析基因的转录产物；获取目的基因；合成cDNA探针；构建RNA高效转录系统。 Northern Blot 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。 应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。 方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析。 变性胶的制备： 琼脂糖0.2g，加入DEPC水12.4ml，加热熔化，稍冷后加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5分钟。 注意事项： （1）RNA的完整性; （2）转膜完全; （3）探针标记的效率、变性; （4）防同位素污染; （5）压片曝光时间。 1、RNA的分离与纯化： 控制RNA酶的活性： 1、控制污染： （1）专用的RNA操作室、专用器械; （2）操作时戴手套; （3）实验用器皿、吸头、离心管应为新的; （4）所配制的水溶液，尽可能用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理。 2、已污染RNA酶的器具的处理 （1）在180℃的高温下干烤6小时或更长时间; （2）氯仿冲洗; （3）双氧水（3