中医药研究常用分子生物学技术2.ppt

第二章 遗传物质及遗传信息的传递 除了少数的RNA病毒之外，DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。 DNA遗传信息的传递——中心法则 遗传信息从DNA到RNA——转录 遗传信息从mRNA到蛋白质——翻译 第一节 DNA的变性、复性和DNA杂交 一、变性(denaturation) 在化学或物理因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋成为单链的过程称为变性。 变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部的双螺旋阶段上 。 DNA变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。 引起DNA变性的因素有：酸、碱（PH=11.3）、热、某些变性剂（如尿素、胍）和某些有机溶剂（如乙醇、丙酮）等。 二、复性（renaturation） 变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程称为DNA复性或退火。 复性可分为两个阶段：首先是成核（nucleation），然后是拉链式(zippering)。 复性开始时,两条DNA单链随机碰撞形成局部双链， 如果是正确的互补区形成的碱基对，就成核（10～20bp）。如果不是正确的互补区，就解开，继续碰撞。 成核后，两条单链的其余部分碱基就像“拉链”哪样完成整个复性过程。 DNA复性速度受多种因素影响： DNA大小与信息的多少 ：DNA片段小的比大的容易复性，反之亦然。信息含量少的比多的容易复性。 离子强度 ：通常增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。所以，要保持单链DNA，盐浓度低于0.01mol/L。 DNA浓度：DNA浓度越大两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性的速度也就越快。 三、杂交 上述复性DNA中，如果两条链来源不同，这就叫做杂交分子。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基序列完全互补，只要有一定同源序性（不同来源）的单链彼此间有一定程度的互补序列就可以形成杂交链。 杂交分子可以在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合成的寡核苷酸单链与RNA或DNA单链之间进行。 第二节 DNA的合成 一、半保留复制 DNA复制时，两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板、按碱基配对原则进行互补合成DNA，新形成的每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semi conservation replication)。 1、复制起点和复制子 DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始，这个特定的位置就称为复制起点(Origin of replication)，用ori表示。 DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。 复制起点在DNA内部 原核生物只有一个复制子 真核生物有多个复制子，每个复制子长约50-200kb。 2、DNA复制的特点 DNA复制的最主要特点（1）半保留复制 （2）半不连续复制(Semi-ondisctinuous replication)。 在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。 以复制叉移动的方向为基准 ，一条链连续复制，为先导链(leading strand) ；另一条链不连续复制，形成冈崎片段(Okaxaki fragments) ，是后随链(lagging strand) 。 二、参与DNA复制的有关物质 模板DNA，三磷酸核苷酸(dATP,dGTP，dCTP，dTTP)是DNA合成的原料。 还需要一些酶参与DNA合成 (一)螺旋酶(Helicase) 又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以促使DNA在复制叉处打开双链。 螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。 (二)单链DNA结合蛋白(SSBP) 单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSBP)能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。 (三)DNA拓扑异构酶(DNA Topisomerase) DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。 DNA拓扑异构酶有两类 ：拓扑异构酶Ⅰ ，如大肠杆菌的ε蛋白(MW-110000) ； 拓扑异构酶Ⅱ ，如大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNAgyrase) (四)引发酶(Primase)和RNA聚合酶(RNA Polymerase) 引发酶催化引物RNA分子的合成 。 RNA聚合酶也是催化RNA分子的合成。 人们认为后随链前体片段的引物是由引发酶