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实验五培养细胞的形态观察和计数 实验目的 了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。 实验用品 一、材料和标本 培养中的几种细胞。 二、器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管。 三、试 剂 0.3% 台盼兰染液等 实验内容 一、培养细胞的形态观察 (一)原理 体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞 , 如内皮细胞,叫贴壁型细胞。体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞-并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如 HL-60, 叫做悬浮型细胞,这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。 (二) 操作 1.从培养箱中取出细胞培养瓶,注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。 2.打开倒置镜光源, 通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。 3.调节载物台的高度进行对焦, 在看到细胞层之后, 再用细调节器将物像调清楚, 注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10×物镜。 （三）结果 贴壁细胞一般有两种形状,即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片, 如HeLa 细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有圆核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起,细胞群常借原生质突连接成网,如 NIH3T3。 贴壁细胞在生长状态良好时,细胞内颗粒少,看不到有空泡,细胞边缘清楚, 培养基内看不到悬浮的细胞和碎片,培养液清澈透明,而当细胞内颗粒较多,透明差,空泡多时,表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌或真菌污染的可能。 悬浮细胞当边缘清楚,透明发亮时,生长较好；反之,则较差或已死亡。 由于培养基内有pH指示剂的存在,因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时,则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多；如呈紫红色,则可能是细胞生长状态不好,或已死亡。 一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的,它随营养、pH、生长周期而改变,但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中,镜下折光率高,圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。 二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定 （一）原理 细胞生物学的实验中,往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度,是进行实验必不可少的一种基本技能。 （二）操作 1.将培养瓶中的培养液倒人干净试管中,向培养瓶中加入 0.25%胰蛋白酶 /0.02% EDTA混合消化液1.0m1,静置3～5分钟,待见到细胞变圆,彼此不连接为止。 2.将试管中的培养液倒回培养瓶中,并轻轻进行吹打,制成细胞悬液。 3.取细胞悬液0.5m1,加入0.3%台盼兰染液0.5ml时,混合后染色 3～5 分钟。 4.滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上,使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生,否则要重新滴加。 在普通光镜10×物镜下计数四个大格内 (如图1， 2 示)的细胞数,压线者数上不数下,数左不数右。 （三）结果 细胞浓度计数 4大格细胞总数×104×稀释倍数/4 = 细胞数／ml （4大格中细胞总数－染色细胞）×104×稀释倍数/4 = 活细胞数／ml悬液 注① 4大格中的每一大格体积为0.l mm3。 1ml＝10000大格，因此，1大格细胞数×104 ＝细胞数／ml。 注② 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上兰色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。 作业 1. 总结培养细胞生长观察方法。 2. 将你计数的每毫升细胞悬液中的细胞总数，死、活细胞的百分比例计算出来。 * * *