17.其它的分子诊断检测技术2013-12-19.ppt

其它的分子诊断技术 检验医学院 周 兰 可以检测基因突变的方法及其优缺点 1??基因突变相关知识和检测技术的复习和总结 1-1 染色体突变（chromosome mutation） 指染色体结构和数量的变异（包括：缺失、重复、倒位和易位），致染色体遗传病 ** 涉及的基因较多 ** 可经光学显微镜分析有丝分裂中期染色体来检出 ** 可在细胞的有丝分裂间期用标记探针检出（染色体原位杂交） 有丝分裂各期特征 间期 ：DNA复制 以及有关蛋白质合成 前期： 膜仁消失现两体。即核膜核仁消失，出现纺锤体 染色体 中期： 形数清晰赤道齐。 即染色体形态、数目清晰， 整齐分布在赤道板附近 后期： 点裂数增匀两极。 即着丝点分裂染色体均匀分布在细胞两极 末期： 两消两现重开始。 即纺锤体、染色体消失， 核膜核仁出现 ，重新开始分裂 细胞分裂的中期：形数清晰赤道齐  染色体形态、数目清晰，整齐分布在赤道板附近 纺锤体清晰可见。这时候，每条染色体的着丝点的两侧，都有纺锤丝附着在上面，纺锤丝牵引着染色体运动，使每条染色体的着丝点排列在细胞中央的赤道板上。分裂中期的细胞，染色体的形态比较固定，数目比较清晰，便于观察清楚 1??相关知识和检测技术的复习和总结 1-2 缺失、重复和插入（涉及多个碱基） 引起移码突变，即DNA片段中某一位点插入或丢失一或几个（非3或非3的倍数）碱基时，可致其后的全部编码顺序发生错位的一种突变 1-3 点突变（point mutation） 是肿瘤和遗传病发生的主要分子机制(癌基因激活和抗癌基因失活等），是基因突变分析的主要内容 点突变的类型 点突变：即单碱基替换（single base substitution） 指由单个碱基改变发生的突变 ，包括： *转换（transition)： 一种嘌呤被另一种嘌呤取代 或一种嘧啶被另一种嘧啶取代 *颠换（transversion）：嘌呤取代嘧啶 或嘧啶取代嘌呤  1-4 点突变的检测方法 1）PCR+探针：PCR-ASO等 2）PCR+其它技术：PCR-SSCP,PCR-RFLP 3）连接酶链反应（LCR） 4）PCR+DNA芯片技术 5）PCR+DNA测序: 实行单分子测序后，勿需PCR 6) PCR扩增阻碍突变系统  镰贫的ASO探针法检测 一对探针（20bp左右），标记后用于杂交检测 SSCP  遗传性耳聋基因检测芯片（图） 乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片 耐药性结核杆菌基因突变检测芯片 1989年在PCR基础上发展起来的、通过PCR和凝胶电泳检测DNA中各种已知点突变的新方法 PCR amplification refractory mutation system 又：PCR amplifcation of specific alleles,PASA alleles-specific PCR,ASPCR 1) 基本原理 TaqDNA聚合酶无3’－5’外切酶活性，不能纠正3’端的错配，因此对于Taq酶的扩增，3’端必须完全配对，以实现高效扩增 当PCR的引物的3’端与模板之间存在错配时，PCR的扩增效率极差，甚至完全不扩增 即“扩增阻碍” 1-1 PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS)  设计两个5’端引物，突变点位于其3’端 A:与正常DNA互补（其3’端与突变基因不匹配) B:与突变DNA互补（其3’端与正常基因不匹配) 设计一个公用的3’端引物（C） 利用这2对引物分别扩增样本（A,C/B,C） 然后,电泳检测 1-1 PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS)  结果判读 2）应用 （1）检测单个位点的突变 （2）检测多个位点的突变：借鉴多重PCR原理，可同时检测4-6种等位基因突变位点 （3）基因分型（纯合突变