组培实验外植体选择处理及接种培养.ppt

6．由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。 刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中或插在器械灭菌器中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。 （二）外植体的培养 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。 培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。 1．光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重 要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下 有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也 有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长 需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮， 促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。 普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx- 5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。 2．温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23?C-32?C之间。培养室一般所用的温度是25?C±2?C。低于15?C或高于35?C，对生长都是不利的。 3．湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。 4．氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。 * 4 无菌操作技术 一、外植体的选择与处理 二、外植体的接种和培养 三、试管苗的驯化与移栽 四、常见问题与解决措施 一、外植体的选择与处理 （一） 外植体的选择 （二） 外植体的处理 （三）污染问题及解决措施 （一）外植体的选择 植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。 1. 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。 2. 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。 3.选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。 4.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm--1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。 (二)外植体的处理 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。 常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润剂，能增强灭菌效果。 常用灭菌药剂的使用和效果 灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果 次氯酸钠 2—3 易 5—30 很好 次氯酸钙 2 易 5—30 很好 漂 白 粉 饱和浓度 易 5—30 很好 氯 化 汞 0.1—1 较难 2—10 最好 酒 精 70—75 易 0.2—2 好 过氧化氢 10—12 最易 5—15 好 溴 水 1—2 易 2—10 很好 硝 酸 银 1 较难 5—30 好 抗 菌 素 4—50mg/L 中 30—60 较好 （三）污染问题