组织培养学实验.ppt

污染的防止 1、选择植物材料 通常老的材料比幼嫩材料带菌多，田间生长比温室材料带菌多，一天中以中午阳光最强时的材料带菌少 2、严格消毒灭菌 采用多次灭菌法 3、合理安排繁殖程序 4、规范操作，控制环境条件 保持接种室的清洁、干燥、密闭等。操作熟练。 （7）植物生长调节物质母液的配制。（微量） ①称量：生长素（IAA、IBA、NAA、2,4-D）或细胞分裂素(KT、ZT、6-BA)50~100mg，（0.05g~0.1g） ②溶解：生长素（IAA、IBA、NAA、2,4-D）可用少量0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，细胞分裂素(KT、ZT、6-BA) 可用少量0.1mol/L的HCI加热溶解。 ③定容：将溶解的生长物质一滴滴倒入不断搅拌的盛有50~60ml蒸馏水的小烧杯中，然后倒入100ml容量瓶，用水冲洗小烧杯数次，最后加蒸馏水定容至100ml配制成浓度为0.5~1mg/ml的溶液。 2、母液的保存 （1）装瓶：将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，注明培养基名称、母液号、配制倍数（或浓度）与配制日期。 （2）储藏：将母液瓶储放在40冰箱内备用。 实验三 MS固体培养基的配制 MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。 MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。 一、目的和要求：通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。 二、材料与用具：配制MS培养基的各种母液、生长调节物质母液、琼脂粉、蔗糖、蒸馏水、移液管量筒、容量瓶、电炉、酸度计或PH试纸、0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的HCI、培养瓶、标签、铅笔等。 三、方法与步骤：（下面取的量是定容1000ml，每小瓶30ml左右，每人接种4小瓶左右。要多少ml？） 1、按母液顺序和规定量，用吸管提取母液，放入盛有一定量的蒸馏水的烧杯中。 母液1 20ml 母液2 10ml 母液3 10ml 母液4 10ml 母液5 20ml(如果是800倍的，母液1.25ml+水18.75ml) 母液6 5ml 2、加入生长调节物质：加入的具体调节物质与量，视培养物不同而异，有时也可不加。 3、加入固化剂：加入琼脂7g。 4、加糖：放入蔗糖30g。 5、定容：加入蒸馏水定容至1000ml。（如是固体琼脂要加热溶化。） 6、调整PH值：经酸度计或PH试纸测试，用0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的HCI把培养基的PH调整到5.8—6.0之间。 7、培养基分注：把配制好的培养基分注到培养瓶中，100—150ml的培养瓶每瓶装入20—25ml左右培养基。分注后立即加盖，贴上标签，注明培养基的名称和配制时间等。 实验四、培养基和培养用具的灭菌 一、实验目的： 1、掌握高温高压湿热灭菌的原理及手提式灭菌锅灭菌操作流程。 2、 探究影响培养基灭菌效果和凝固效果的主要因素。 二、 实验原理：培养基和培养用具一般采用高温高压湿热灭菌法来进行灭菌， 其灭菌原理是利用高温高压产生的蒸汽杀灭微生物的方法， 因为热蒸气具有较强穿透力 ，可使蛋白质凝固而达到灭菌的目的。 培养基高温高压湿热灭菌是压力在 0. 11-0. 15MPa(温度为 121-126℃ ) ， 保持该压力 15-30 min， 即可达到灭菌目的。 三、 材料、 仪器与试剂 1、仪器: 高压灭菌锅 2、用 具: 集装框、 手套、 计时器 四、实验步骤 1、洗涤：把组织培养基用 的培养皿、 三角 瓶、 试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自 然晾干或烘箱干燥。 2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。 3、加水：往锅里加水至浸没发热管( 切忌干烧! ) 。 4、装锅：在灭菌锅内 放入含培养基的培养瓶或三角 瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。 5、封锅、 接通电源: 盖好锅盖， 对角线拧紧螺旋。关闭放气阀和安全阀， 接通电源， 加热。 6、排冷空气：当压力达到 0. 05Mpa 时，打开手动放气阀放冷气， 将锅内