细胞复苏及细胞鉴别与计数.doc

细胞生物学实验报告 细胞复苏及细胞鉴别与计数 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： Part1、细胞复苏 一、实验原理 细胞复苏是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。 复苏细胞原则：快溶。防止在融化过程中已融解水渗透入细胞导致的二次结晶对细胞形成损害。使培养物能快速通过对细胞有损害的－5～0℃摄氏度区域，细胞仍能生长，活力受损不大。 二、实验目的 掌握细胞复苏的基本方法 三、实验器材 （1）仪器? CO2培养箱，显微镜、倒置显微镜，超净台? （2）材料? 培养瓶，试管，移液管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，冻存的Hela人宫颈癌细胞，滴管 （3）试剂? 完全培养基（DMEM），小牛血清，双抗 四、实验步骤 1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯40℃的温水。 2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟内融化。 3、将冻存管放入离心管中800rpm离心10分钟，取出冻存管拿入超净台中，75%酒精消毒管口，打开冻存管，弃上清。 4、沉淀加1ml完全培养基吹打细胞使之均匀，将细胞转移至25ml培养瓶中，补加3ml新鲜培养基于干净培养瓶中培养。 5、另取90微升细胞悬液于1.5ml离心管中，再加入10微升0.4%台盼蓝染色,取80μl细胞液镜下观察活力。 6、再向上述培养瓶中加入4ml10%含FCS及双抗的DMEM培养基，轻轻混匀，显微镜下观察。盖上瓶盖, 去倒置显微镜上观察细胞形态。做好标记。将瓶盖适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 7、将用过的试剂仪器等摆回原处，将超净台打扫干净，关闭照明灯及抽风机。 8、实验后数小时后去观察细胞生长情况，并拍摄照片。 五、实验结果 传代后在显微镜,细胞形态完整。也存在少数， Part2、细胞的计数与死细胞的鉴别 一、实验原理 细胞计数方法：血球计数板。 血球计数板：由一块长约7.5cm，宽3.5cm的厚玻璃制成。计数室的边长为1mm，中间平台下陷0.1mm，盖上盖片后计数室的容积为 0.1mm3。所以，可根据在显微镜下观察到的细胞数目，换算成单位体积中细胞的数量。 细胞计数：细胞压格计上线不计下，计左不计右，如有少量两个以上细胞按一个细胞计数，如超过10%说明消化不充分。 通常认为细胞膜丧失完整性,细胞即可被认为已经死亡.台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂.健康的正常细胞能够排斥台盼蓝,而死亡的细胞,膜的完整性丧失,通透性增加,细胞可被台盼蓝染成蓝色.依据此原理,细胞经台盼蓝染色后,可通过显微镜,直接镜下计数或拍照后计数,实现对细胞存活率比较精确的定量分析. 二、实验目的 1、掌握用血球计数板进行细胞计数的方法。 2、学习死活细胞的鉴别方法 三、实验器材 （1）仪器?CO2培养箱，显微镜、倒置显微镜，超净台? （2）材料 培养瓶，试管，移液管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，冻存的Hela人宫颈 癌细胞，滴管、血球计数板 （3）试剂?完全培养基（DMEM），小牛血清，双抗，台盼蓝染料 四、实验步骤 1、检查记数板：在正式计数前，先用显微镜检查记数板的计数室，看其是否沾有杂质或干枯的菌体。若有污物，则需作以下几步清洗： （1）、擦洗 用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室。 （2）、冲洗 用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分注意：勿用内火焰来烤干，最后用擦镜纸揩干净。 2、镜检：镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数。 3、加样：先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2~3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。 4、计数： 将加好样品的记数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作： （1）找计数室：先在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格网位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。 （2）转高倍镜：转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰