MTT方法总结.doc

MTT方法总结 1.MTT原理 MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT，原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan(甲瓒）后者的产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长490nm和570nm处进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。 2.优点 （1）有灵敏度高，重复性好，（2）操作简便、经济、快速、易自动化的优点，（3）而且没有3H—TdR掺入试验放射性污染，（4）还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素 缺点：影响因素多，重复性较差。MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护 3.步骤(1)接种细胞：用0.25％ 10％RPMI1604培养液配成单个细胞悬液，以每 孔5×103~1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。(2)培养细胞；将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO24h以上（至细胞状态稳定）．加药物干预24~48h(培养时间取决于实验目的和要其求)(3)呈色：加MTT时一定要避光，测24h细胞增殖率时，于加药干预20h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul，37℃，继续孵育4h；测48h细胞增值率时，于加药干预44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，继续孵育4h。 终止培养后，对悬浮生长的细胞，需离心,(2000rpm．15min2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150uL DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解。(4)比色：选择490nm和570nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。 注意事项(1)选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，接种前需计数，根据查阅文献决定不同细胞的接种个数，一般以每 孔5×103~1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200uL。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。 （2）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。15％l0％5个浓度（每个浓度相差10倍），一个浓度设4个副孔。（4）设空白对照和正常对照，每块板设空白复孔,内加培养液，不含细胞与药物，各做4~6个复孔，取平均值，主要目的是为了减少培养基含有的酚红对比色的影响。每种细胞设4~6个正常对照孔,含细胞不含药物，每孔加样100μL/孔。（对照，不含细胞，含药物和培养基？） （5）细胞铺板时，要充分分散，而且要加几个孔就重新吹散一次，否则，细胞浓度就会不同。（我曾经试验过，用后加的孔作试验组与用先加的孔作对照组，结果有些差异，也许是我的熟练程度不行！）另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。（6）培养后，细胞的培养既要吸干净，否则，残留的蛋白会对MTT有一定的吸附作用，影响就过准确性。我使用的是翻转法，将培养液倒掉，这样做很简便，又很快洁。重复性也不错。（7）测吸光度值要有一定的时间范围，在测定是你会发现，随着时间的推移没空都会变深些，（这可能是由于MTT在空气中氧化的结果，我记不清了，你再找找书，另外，具体时间我也没有记清）（8）阳性药物的选择，要选择经典的，有说服力的，又对你的细胞有很好的杀伤了力的药物。别认为简单，我就曾经因为阳性药物选择错误而重新做试验，惨痛的教训呀！！ （9）如果用96孔板，周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因，会误差很大，尽量不用。（10）溶解甲臢时，如果是悬浮细胞或细胞贴壁不牢，尽量用酸性SDS溶解，不要弃去培养液，以免细胞损失。这还要求最后加入药物和MTT时，血清浓度低于10%。 6.如何计算IC50用抑制率作为Y，加药浓度的对数作为X，进行线形回归，根据得到的方程求抑制率是50%时的加药浓度，也就是IC50。IC50的计算和LD50的计算很相似，可以用SPSS计算。以剂量为横坐标，以抑制率为纵坐标（Y）。进行回归分析也可以，即用抑制率作为Y，加药浓度的对数作为X，进行线形回归，根据得到的方程求抑制率是50%时的加药浓度，也就是IC50。但是这有要求：抑制率最好在30-70％S型曲线，在药物浓度很高或很低的时候就接近一个平台，所以加药剂量的选取非常重要，在不知道药