质谱在生物微透析中的应用与进展-微透析与质谱.PDF

微透析与质谱 熊少祥 微透析（Microdialysis ，MD ）是一种优良的在线取样方法，其最大的优点是：在基本不 干扰生物体内正常生命过程的情况下，进行活体(in vivo) 、实时(in time) 、在线(on line) 取样， 特别适合研究生命过程的动态变化。Bito 等1966 年首先报道了应用半透膜可以用在对狗的血 浆和大脑的细胞外液的取样分析，随后微透析广泛的应用于生物活体的神经传质的研究，由 于质谱分析的快速，灵敏和进样量少等特点，其与微透析联用对生物活体的在线研究有不可 替代的作用。 微体积取样能力的要求，使得微透析在酶和底物的特性分析研究中成为重要的手段，尤 其是与高灵敏的检测系统联用时。质谱作为一种有力的检测手段，得到的分子和碎片离子， 可以较好地提供样品的结构信息。随着电喷雾电离源（ESI ）和基质辅助激光解吸电离源 （MALDI ）的应用和发展，质谱越来越成为生物分子的一种重要分析技术，尤其是 ESI-MS 可以通过碰撞诱导碎裂（CID ）提供生物大分子的基本序列信息和结构信息，其重要作用已日 渐突出。质谱在生物样品分析中的最大缺陷是存在一些物质效应，如盐及小分子物质的存在， 将严重影响样品分子的离子化效率，导致检测灵敏度下降，甚至无法得到检测信号。因此， 用微透析脱盐，除去生物样品基质的干扰，也成为其在质谱应用中的一个重要方面。Liu 等对 DNA 等生物样品分析时，应用在线微透析可以降低盐的浓度至250mM ，证实了微透析去盐的 [1] 快速和高效 。 1. 微透析原理 微透析采用透析技术，关键部分是透析膜，仅仅允许水分子和其他小分子透过，膜内灌 注液体介质，这种介质与膜外液流（通过向两个方向的扩散）达到平衡。微透析体系的基本 部件包括：透析针，连接管，灌注介质，注射泵，样品收集器（图1）。样品可以通过样品收 集器收集，也可以通过在线注射阀引入分析系统。实验动物置于相应设计的装置中，要求动 物自由活动而不影响或者破坏连接管。 图1 基本微透析系统示意图，组成包括驱动注射液的注射泵，微透析探针和连接管 微透析探针的设计大致有三种：线型方案，同轴方案，并列分路式方案（图 2 ）。透析针 插入生物组织或生物母体，灌流液由注射器推入膜内套管，透析膜孔径大小允许小分子自由 扩散通过而阻止蛋白质等大分子通过。被测分子足够小可以扩散通过透析膜，透析液按顺序 依次通过内外套管，出口管，样品收集器进行样品收集或在线分析。 图2 微透析探针设计三种方案示意图 （A ）线型，（B ）同轴型，（C ）并列分路型。 图中阴影部分代表透析膜，箭头指向为注射液流过探针的方向 透析针的选择主要根据插入的部位而定。线型方案使透析针插入球型组织时非常有利； 而在活体脑透析中，同轴型针使用最为典型和普遍。并列式方案和环型方案实际上是同轴型 的改进模式。前者由熔融硅管相互并列粘合，表面覆盖一层柱型透析膜。这种设计考虑到在 2 动物运动时允许透析针弯曲以免结构损伤；后者透析膜的长度相对较长，约2～4cm，适合于 皮下组织、腹膜取样。并列分路式透析针Lunte 和Gunaratna 分别应用于胆汁的活体微透析取 样，得到较高的回收率。 二十年前就有工作者开始尝试微透析与质谱的联用。1990 年Menacherry 和Justice 将微透 析与热喷雾串联质谱联用，测定了老鼠脑细胞外液多巴胺水平；1991 年 Caprioli 和 Lin 采用 FAB-MS 检测了老鼠体内盘尼西林的药物动力学过程；液相色谱质谱联用及电泳质谱联用也逐 渐被报道。 微透析效率取决于透析针的透析效率。描述透析针的透析效率时，科学工作者通常采用 [2] Bungay －Morrison 模式 ，定义透析分数（EF ）为： out in in EF= (Cd －C