第三章蛋白质-b化院.ppt

2 粗分级（rough fractionation) 一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） ② 等电点选择性沉淀法 ③ 有机溶剂分级沉淀法 ④ 热处理选择性沉淀法 ⑤ 生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法 3 细分级（fine fractionation) ① 透析除盐 ② sephdex G-25凝胶过滤除盐 ★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附 层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、 滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、 盘状电泳、等电聚焦、双向电泳 ★密度梯度离心 浓缩与保存 浓缩方法： 保存方法： ① 晶体保存： 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅 是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。 纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、 加有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ② 冻干粉保存： ③ 溶液保存： 加入抗冻剂（50%甘油）后-20~-70℃保存。 二? 分离纯化蛋白质的主要方法 ★ 根据蛋白质的溶解度分离 ★ 根据电荷差异分离 ★ 根据分子大小分离 ★ 根据配体特性异性分离（亲和层析） ★ 选择性吸附分离（物理吸附） ★ 根据疏水性的差异 半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。 1 透析和超滤法 施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子 离心机结构示意图 转头 转头腔 沉降样品 驱动马达 真空 冷冻 2 离心法 沉降系数（sedimentation coefficient） 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。 数学定义式为： 沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围，为方便起见，把1×10-13作为沉降系数的一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。 沉降系数（s）与相对分子量（Mr）的关系: Mr = RTs D(1-??) Svedberg方程: d? /dt ?2 ? s = 沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析 蔗糖密度剃度 聚蔗糖密度剃度 交联葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P ，） 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A） 3 凝胶过滤法 交联葡聚糖（Sephadex） 4. 电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 ◆ 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 ◆ 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电 泳。 ◆ 从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、 凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等）。 等电聚焦 等电聚焦电泳法测定蛋白质pI 垂直平板电泳 二维电泳 等电聚焦 垂直平板电泳 2D gel in proteomics 5. 离子交换层析法： 离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖： 交联葡聚糖离子交换剂 6. 亲和层析 配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素 与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋 白），凝集素。 ◆ 免疫亲和层析 ◆ 凝集素亲和层析 三 蛋白制品的含量分析、纯度鉴定与活性分析 （一） 含量分析 总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、 考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot) MOV : MCB4.0 \ IMMUNOBLOTING （二）纯度鉴定（均一性） 基本手段： ◆ 电泳分析：单条带。 ◆ N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） 其它鉴定工作： 1）分子量的测定 2）等电点测定 3）C-末端AA的测定（肼解法） 4）分子中糖链 ① 血球凝集反应； ② 糖蛋白电泳（甲苯胺兰、schiff试剂）； ③ 糖组分分析（层析、液相色谱） 5）含脂成分 苏丹黑预染、电泳。 6）光吸收