第三章载体与宿主的选择ye.ppt

第三章 基因工程载体及宿主 5 人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 5.1 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 oriS, repE - F for plasmid replication and regulation of copy number. parA and parB for partitioning F plasmid DNA to daughter cells during division and ensures stable maintenance of the BAC. A selectable markers for antibiotic resistance, some BACs also have lacZ at the cloning site for blue/white selection. T7 Sp6 phage promoters for transcription of inserted genes. 5.2 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 50-400k 人工染色体 20-45k 粘粒载体 1.5k M13噬菌体载体 10-25k λ噬菌体载体 0-3k 质粒载体 插入大小 6 真核细胞的克隆载体 6.1 酵母细胞中基因克隆常用载体 共同特点 （1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增； （2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记； （3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型的载体 1.整合型载体（YIP） 2.复制型载体（YRP） 3.附加体型载体（YEP） YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。 YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（Shuttle Vector）.穿梭载体在基因工程中广泛使用。 YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失 YEP型载体……….. 6.2 植物基因克隆的载体——Ti质粒 Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称Ti质粒。 6.3 动物细胞基因克隆的载体: SV40病毒载体 SV40病毒（猿猴空泡病毒40）呈小型20面体，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3构成。 受纳细胞（permissive cell）：能使