第三章蛋白质-b2013.ppt

施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子 离心机结构示意图 转头 转头腔 沉降样品 驱动马达 真空 冷冻 2 离心法 沉降系数（sedimentation coefficient） 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。 数学定义式为： 沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围，为方便起见，把1×10-13作为沉降系数的一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。 沉降系数（s）与相对分子量（Mr）的关系: Mr = RTs D(1-??) Svedberg方程: d? /dt ?2 ? s = 沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析 蔗糖密度剃度 聚蔗糖密度剃度 交联葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P ，） 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A） 3 凝胶过滤法 交联葡聚糖（Sephadex） 4. 电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 ◆ 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 ◆ 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电 泳。 ◆ 从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、 凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等）。 等电聚焦 等电聚焦电泳法测定蛋白质pI 垂直平板电泳 二维电泳 等电聚焦 垂直平板电泳 2D gel in proteomics 5. 离子交换层析法： 离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖： 交联葡聚糖离子交换剂 6. 亲和层析 配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素 与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋 白），凝集素。 ◆ 免疫亲和层析 ◆ 凝集素亲和层析 三 蛋白制品的含量分析、纯度鉴定与活性分析 （一） 含量分析 总蛋白含量分析： 凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、 考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot) MOV : MCB4.0 \ IMMUNOBLOTING （二）纯度鉴定（均一性） 基本手段： ◆ 电泳分析：单条带。 ◆ N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） 其它鉴定工作： 1）分子量的测定 2）等电点测定 3）C-末端AA的测定（肼解法） 4）分子中糖链 ① 血球凝集反应； ② 糖蛋白电泳（甲苯胺兰、schiff试剂）； ③ 糖组分分析（层析、液相色谱） 5）含脂成分 苏丹黑预染、电泳。 6）光吸收 全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸收。 7）AA组分分析 五 蛋白质的变性与复性 　 ● 蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。 表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变 应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老…… ●蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。 变性的因素： ? 强酸和强碱； ? 有机溶剂：破坏疏水作用； ? 去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用； ? 还原性试剂：尿素、?-硫基乙醇； ? 盐浓度：盐析、盐溶； ? 重金属离子：Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基 团反应。 ? 温度； ? 机械力：如搅拌和研磨中的气泡。 蛋白质变性后，往往出现下列现象： ①生物活性丧失 ②硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。 ③溶解度降低、沉淀，粘度增加。 变性的实质： 次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。 变性不涉及一级结构的破坏