第三章重组dna分子的方法1南理工的课件.ppt

（五）质粒拷贝数 在细胞中，核糖体的数量远远大于mRNA的数量，所以，mRNA分子的数量对蛋白产量起到重要的作用。选择高拷贝的质粒可以提高mRNA的表达水平。 由于细胞中质粒拷贝数增加会影响细胞的生活力，所以不希望质粒数在任何时候都高，希望构建一种拷贝数可控的质粒。 pCP3质粒是将含强启动子PL的质粒pPlc2833，将pKN402上的温度敏感型复制序列转移到该质粒上即构建成pCP3质粒。 重组后的质粒的拷贝数对温度的敏感性加强。 温度敏感控制型质粒 3.2.3 腺病毒克隆载体 3.2.3.1 腺病毒的一般生物学特性 腺病毒（adenovirus, Ad）是一类无囊膜的20面体病毒，含一个线形双链DNA分子（Ad－DNA）。从成熟的病毒颗粒中分离的DNA具有传染性。 3. 2.3.2腺病毒克隆载体的构建 野生型腺病毒最大外源DNA容量约为2kb,如果将病毒非必需基因组缺失，再由反式作用提供补偿，可既增加克隆载体携带外源DNA容量，又不影响病毒在包装细胞中复制增殖。理论上除腺病毒基因组两端约500bp的顺式结构是复制和包装所必需的结构外，其它结构均可被替换成外源DNA。 3..2.3.3 腺病毒克隆载体的应用 基因治疗癌症 表达真核基因 研究疫苗 3.3 限制性核酸内切酶和DNA片段化 3.3.1 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶（restriction endouclease）是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶（endo-deoxyribonuclease） 酶切音像 限制性核酸内切酶一般以提取这类酶的生物的属名和种名的第1、2个字母以及菌株（型）的代号来命名。如果从同一种生物中先后提取到多种限制性核酸内切酶，则依次用罗马数字表示。 Haemophilus influenzae Rd中提取到的第三种限制性核酸内切酶被命名为Hin dIII 限制性核酸内切酶一般以提取这类酶的生物的属名和种名的第1、2个字母以及菌株（型）的代号来命名。如果从同一种生物中先后提取到多种限制性核酸内切酶，则依次用罗马数字表示。 Haemophilus influenzae Rd中提取到的第三种限制性核酸内切酶被命名为Hin dIII 3.3.2 限制性核酸内切酶作用机制 限制性核酸内切酶以环状和线形的双链DNA为底物，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3‘－OH基团和5’－P基团的片段 3.3.3 限制性核酸内切酶的识别序列 限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。 多数限制性核酸内切酶的识别序列有6个核苷酸对组成。少数限制性核酸内切酶的识别序列由4个或5个核苷酸对组成，或者多于6个核苷酸对组成。 各种限制性核酸内切酶的识别序列看出，他们有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补对称。 为了便于书写，识别序列可以以5‘ ? 3’ 走向的单链DNA表示如识别序列 5‘AAGCTT3’ 3’TTCGAA5’ 可以写成AAGCTT。 一般来说，同一种DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。原则上有n个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n 。 如Sau 3A的识别序列只有4个核苷酸GATC，则间隔256（44）个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列； Not I的识别序列有8个核苷酸GCGGGCCGC,则须间隔65356(48)个核苷酸才有一次机会出现这个识别序列。 有一些限制性核酸内切酶虽然来源不同，但是具有相同的识别序列。这样的限制性核酸内切酶被称为同裂酶（isoschizomer） 3.3.4 限制性核酸内切酶切割DNA的位点 DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点。 限制性核酸内切酶切割产生的DNA片段末端，通常有两种形式： 两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置的两侧。这样的DNA片段末端称为黏性末端。 DNA片段末端的3‘端比5’端长，称为3‘黏性末端。 DNA片段末端的5‘端比3’端长，称为5‘黏性末端。 两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置出在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果，产生的DNA片段末端是平齐的，称之为平末端。 为便于书写，限制性核酸内切酶在双链上的切割位点可用5‘?3’走向的核苷酸链表示，如 5‘-C TGCA?G-3’ 3’-G?-ACGT C-5