第二十章重组dna技术教学.ppt

科学出版社案例式教材《生物化学》课件 基本概念 基本概念 基本概念 基本概念 自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 重组DNA技术的发展简史 第一节 重组DNA技术的基本过程 第二节 重组DNA技术中常用工具酶 一、限制性核酸内切酶 （一）限制性核酸内切酶的命名 （二）限制性核酸内切酶的类型 Ⅰ型限制性核酸内切酶 Ⅱ型限制性核酸内切酶（应用广泛） Ⅲ型限制性核酸内切酶 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA （三）Ⅱ型限制性核酸内切酶 （3）产生平末端 (blunt end) (四）限制酶作用的影响因素 DNA底物的纯度 DNA的甲基化程度 DNA分子的结构 酶切反应的温度 酶切反应的时间 酶切反应的缓冲体系 二、 连接酶(DNA ligase) 三、DNA聚合酶 四、其它修饰酶 第三节 重组DNA技术中常用载体 作为基因工程载体所需具备的基本条件 能自主复制 有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS），利于外源DNA分子插入 具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定 分子量小，以容纳较大的外源DNA 拷贝数高 具有较高的遗传稳定性 一、质粒载体 （一）pBR322质粒载体（克隆6kb） 二、噬菌体（bacteriophage）载体 （一）?噬菌体 (phage)载体 （二）粘粒 (cosmid)载体 （三）M13噬菌体载体 ?噬菌体插入较大外源DNA片段（23kb） 三、人工染色体载体 人工染色体载体包含的调控元件 第四节 重组DNA技术基本原理 一、目的基因的获得 （一） 化学合成法 （二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) （三）从基因文库中筛选 （一） 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列 三、目的基因的体外重组 DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子（目的基因）与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程 （一）黏性末端连接 基本方法： 目的基因与载体分子经同一限制性核酸内切酶切割成具有相同黏性末端的DNA片段后，可通过黏末端互补配对，再借助DNA连接酶封闭缺口，形成完整的重组DNA分子 （二）平末端连接 （三）人工接头连接 （四）同聚物加尾连接 四、重组DNA分子的导入 宿主细胞应具备的条件 处于感受态 对载体无严格限制 限制酶和重组酶缺陷 不对外源DNA进行修饰 能表达重组体所提供表型特征 五、重组DNA分子的筛选与鉴定 （一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 （二）限制性核酸内切酶酶切鉴定 （三）核酸分子杂交法 （四）PCR法 （五）免疫化学检测法 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 识别序列 外源DNA 酶切位点 酶切位点 EcoRⅠ酶切 PvuⅡ酶切 粘性末端 平末端 双酶切载体 DNA连接酶 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 5′ 磷酸钙转染 DEAE-葡聚糖介导转染 电穿孔转染 脂质体转染 显微注射 转化 转染 感染 2.多核苷酸激酶： 　　在重组DNA技术中，多核苷酸激酶可用于标记DNA的5′末端，也可使缺失5′-P末端的DNA发生磷酸化作用。 3.碱性磷酸酶： 　　能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5′磷酸基团。在重组DNA技术中，用碱性磷酸酶去除载体分子或DNA片段的5′-P，以防止发生自身连接。 定义 为携带目的基因，实现其无性繁